耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性及SCC mec分型研究

张亚彬，张倩雯，王佳伟

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建 福州 350025；2.厦门大学公共卫生学院，福建 厦门 363601)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是临床最常见的革兰氏阳性耐药菌，能够导致败血症、肺部感染等严重感染性疾病，发病率和死亡率较高[1-3].近年来，全球范围内MRSA检出率呈明显上升趋势，受到临床广泛关注，其高发病率和死亡率已成为医学界治疗的难题.

MRSA的耐药机制各不相同，临床对MRSA菌株耐药性检测的要求也日益增加.葡萄球菌染色体mec基因盒(SCC mec)基因分型方法具有较高的特异性和分辨率，广泛用于辅助临床制定治疗方案.SCC mec是细菌产生耐药性的主要调控部位，多种耐药基因能够插入SCC mec并在其中聚集，之后从染色体结构中自行脱离[4].由于基因复合结构存在差异，临床上将MRSA分为5个亚型，其中Ⅰ～Ⅲ型被认为是医院获得型MRSA，具有较多的耐药基因，抗感染治疗难度高，是导致患者死亡的主要原因；Ⅳ～Ⅴ型为社区获得型MRSA，耐药基因相对较少，抗感染治疗也比较容易.

本研究通过MRSA的药敏试验指导临床对MRSA的治疗和预防，并以PCR及琼脂糖凝胶电泳为基础，对50株MRSA进行SCC mec分型，了解其耐药基因携带情况及流行情况，以预防MRSA的爆发性感染.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

收集中国联勤保障部队第九〇〇医院2018年临床分离的MRSA菌株50株，其中来自导管1株，分泌物32株，粪便1株，腹水2株，关节液1株，脑脊液1株，脓液4株，切口液1株，渗液1株，血液5株，组织1株.来自男性标本33株，女性标本17株.所有菌株均置于-80 ℃冰箱保存.

1.1.2 主要仪器

恒温培养箱(上海仙象仪器仪表有限公司)；小型高速离心机(杭州奥盛仪器有限公司)；PCR扩增仪、WD-9413B凝胶电泳成像仪(Bio-Rad公司，美国)；WalkAway药敏分析仪(北京市六一仪器厂).

1.1.3 主要试剂

哥伦比亚血琼脂平板、MH平板、0.9%生理盐水、灭菌注射用水(梅里埃(上海)生物制品有限公司)；10倍浓缩PCR buffer(含MgCl2,上海远莱生物科技公司)；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)；Taq酶、DL2000marker染色液、50×TAE缓冲液(上海百蕊生物科技有限公司)；革兰氏阳性球菌鉴定及药敏板PC33、快速MIC板用分注槽(Beckman Coulter，美国).

1.1.4 主要试剂配制

取20 mL 50×TAE缓冲液与980 mL去离子水混匀，室温保存.2%琼脂糖凝胶：称取1.2 g的琼脂糖，加入60 mL电泳缓冲液，反复煮沸3～5次，至溶液清澈透明后倒入模板中，静置凝固1 h.现制现用.

1.1.5 引物合成

SCC mec和mec A引物序列见表1，参考文献[5]的方法，委托苏州泓迅生工生物科技有限公司合成PCR扩增引物.

表1 引物序列

1.2 实验方法

1.2.1 菌株复活及DNA制备

将菌株从-80 ℃冰箱中取出，室温放置0.5 h使其解冻；接种于血琼脂平板，35 ℃温箱培养18～24 h，对菌落进行分离和纯化，具体操作：选取3～4个菌落加入2 mL无菌生理盐水中，混合均匀后在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入100 μL灭菌注射用水，混合均匀后置于100 ℃水浴锅中煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min；取上清于-20 ℃保存备用.

1.2.2 mec A基因鉴定及SCC mec分型

引物序列见表1.PCR反应体系20 μL(上游引物和下游引物各1 μL，Buffer 5 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，cDNA 1 μL，双蒸馏水10.5 μL)，扩增反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环，72 ℃延伸5 min.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后通过成像仪检测目标条带灰度值.

1.2.3 病原菌药敏检测

K-B纸片法：分离单个菌落，使用无菌生理盐水配制成0.5麦氏比浊，用接种针将菌落溶液反复涂抹在MH血琼脂平板表面，室温放置3～5 min后，将药敏纸片轻轻贴于平板上，相邻纸片中心间隔不少于24 mm，每块平板最多贴6个纸片，静置于35 ℃孵育箱中24 h.所用药敏纸片为多西环素、替考拉宁、氯霉素、克拉维酸、阿奇霉素药敏纸片，测量抑菌圈大小.判读标准见表2.

表2 K-B纸片法判读标准

MIC法:用无菌接种环取单个菌落，使用快速接种针挑取单个菌落，将周围菌落除去后插入接种水中，充分混合均匀，转入分注槽，将接种水定量转至革兰阳性菌药敏鉴定复合板中，使用全自动药敏分析仪进行测定.判读标准见表3.

表3 MIC法判读标准

2 结 果

2.1 mec A基因鉴定结果

经PCR检测，50株MRSA中 mec A基因检出48株(96.00%).见图1.

2.2 SCC mec分型结果

通过PCR方法检测50株MRSA的SCC mec基因型，结果显示：50株MRSA中4株在280 bp位置出现条带，为SCC mecⅢ型；3株在776 bp位置出现条带，为SCC mecⅣ型；其余43株均未出现条带，PCR电泳结果见图2.

2.3 药敏试验结果

50株MRSA中，未检出对万古霉素、利奈唑胺和达托霉素耐药的菌株，而对苯唑西林和青霉素的耐药率达到100%.其他药物耐药情况见图3.

3 讨 论

3.1 MRSA耐药情况分析

MRSA是目前临床上发现耐药性最强的革兰氏阳性菌，由于近年来抗菌药物的不合理应用，造成MRSA检出率呈快速上升趋势，且耐药性日趋严重,严重威胁患者的生命安全，也给临床治疗带来较大困难[5].赵蓉芬等[6]报道，MRSA对红霉素、罗红霉素、阿奇霉素等大环内酯类抗菌药物的耐药率很高.李桂梅等[7]对临床检出的MRSA菌株耐药性分析显示，其对环丙沙星的耐药率为97%，对阿奇霉素的耐药率为96%，对罗红霉素的耐药率为99%，仅对糖肽类抗菌药物和利奈唑胺有较好的敏感性.

本研究显示：MRSA对于糖肽类抗菌药物和达托霉素具有100%的敏感性，对四环类抗菌药物、喹诺酮类抗菌药物、氯霉素、利福平的敏感性较高，与李桂梅等[7]报道中喹诺酮类抗菌药物对MRSA的耐药率在80%以上的结论不一致，其原因可能为：我国不同地区感染防控工作水平和抗菌药物使用情况不尽相同，MRSA流行株具有较大的地域性差异.福州市目前流行的MRSA菌株对喹诺酮类和四环素类抗菌药物具有较高的敏感性，在临床治疗中可根据患者病情严重程度合理应用.有报道[8]显示：新疆某地区的MRSA菌株对于四环素类药物以及喹诺酮类药物耐药性较高，呈现出严重的多重耐药现象.本研究也发现：MRSA对大环内酯类抗菌药物和克林霉素具有较高的耐药率，提示在临床治疗中应避免使用该类抗菌药物.糖肽类抗菌药物和利奈唑胺是目前指南中治疗MRSA的推荐抗菌药物，本研究中也未检出耐药菌株，提示本地区MRSA对上述抗菌药物敏感性很好，在临床治疗中可选用.

3.2 mec A基因检测结果分析

相关研究[9]显示：检测mec A基因有助于临床诊治MRSA，mec A基因在MRSA耐药性中具有十分重要的作用.mecA是源自肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌的外源性基因，通过转座子整合在染色体第10节段上.Mec A基因编码的青霉素结合蛋白2a可结合失活的部分，促进细胞壁的合成.本研究mec A基因检出率为96%，但所保留的菌株确实为MRSA.已有研究[10]表明：在-80℃下储存2 a后，250个MRSA分离株中出现36个(14.4%)mec A基因丢失菌株.因此，本研究中有两株MRSA未能检测出mec A基因，可能与上述原因有关.

3.3 SCC mec分型结果分析

葡萄球菌染色体mec盒结构包括mec操纵子、crr复合物、无功能区，主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5种亚型，其中SCC mec进一步分为a～d 4种亚型.目前研究发现：全球不同国家的MRSA流行类型存在较大差异，韩国、泰国以SCC mecⅡ型为主，日本以SCC mecⅤ型为主，中国、印度以SCC mecⅢ型为主.我国不同省份的MRSA流行分型也存在一定差异，邹玉涵等[10]报道流行菌株为SCC mecⅡ型；张宇琼等[11]报道流行菌株以SCC mecⅡ型(38%)和SCC mecⅤ型(35%)为主；徐银海等[12]报道显示：我国流行分型以SCC mecⅢ型为主，是各亚型中耐药基因检出数量最多的亚型，耐药现状最为严重，所以各地区应加强对MRSA的防治工作，避免出现感染暴发事件.

本研究50株MRSA中，检出SCC mecⅢ型4株，SCC mecⅣ型3株，未分型43株，未分型菌株数量较多，与目前国内大多数分型结果均不一致，推测原因：本研究检测的MRSA菌株标本经超低温保存后可能存在基因缺失，导致RCR扩增引物无法与模板相互结合；对抗菌药物耐药性的分析结果也与部分研究存在一定差异，需要后续试验进行验证.

本研究发现：MRSA尚未出现严重的多重耐药现象，当临床发现MRSA后经验用药时推荐使用万古霉素、达托霉素或利奈唑胺进行治疗.