掺锶复合PVA/生物活性玻璃水凝胶的制备及其体外软骨修复性能研究*

林博偲 王会 李久盛 蒋海珍 曾祥琼

由机体老化、不健康运动、机械创伤和软骨病变引起的关节软骨损伤问题正日趋严重，并且已经严重威胁着患者的身心健康[1]。然而，关节软骨内部缺少神经和血管、软骨细胞数目较少，导致关节软骨几乎不具备自我损伤修复的能力。软骨损伤的再生修复是目前临床上亟待解决的问题[2-4]。但是，目前的市面上的人工软骨的生物相容性不佳、力学性能差，临床上修复效果不理想。因此，亟需制备一种具有高机械强度且生物相容性良好的软骨修复材料。

生物活性玻璃（bioactive glass，BG）作为可植入生物材料领域最具潜力的材料之一，因其良好的生物相容性和降解性能，可作为骨植入材料并广泛应用于组织再生领域[5]。然而，弹性模量低和表面不稳定性是其主要缺点，影响了BG 作为生物支架的机械强度。聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）具有无毒、韧性高、易改性等优点，是一种性能优良的高分子材料，可以作为改性材料使用[6]。本研究将PVA和BG 制成水凝胶以模拟天然软骨的结构，掺杂锶元素提高成软骨性能，研究水凝胶浸泡在磷酸盐缓冲液（PBS）中的可降解性能、离子释放性能和结构变化。通过在水凝胶上培养小鼠软骨细胞，对其细胞形态、细胞增殖进行分析，评价水凝胶在体外软骨修复中的应用效果。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及材料

EO20-PO70-EO20（P123）、正硅酸四乙酯（TEOS）、三水合硝酸钙[Ca (NO3)24H2O]、磷酸三乙酯（TEP）、盐酸（HCl）购自Sigma-Aldrich 公司（美国）。聚乙烯醇（PVA）和乙醇购自阿拉丁公司（上海）。差示扫描量热仪（DSC3，Mettler Toledo，瑞士），电感耦合等离子体发射光谱仪（Avio200，PerkinElmer，美国），pH 计（FiveEasyPlus，MettlerToledo，瑞士），X 射线衍射仪（D8Advance，Bruker，德国），扫描电镜（SU-70，日立，日本），酶联检测仪（Imark，Bio-Rad 公司，美国）。

1.2 PB、PB-Sr 水凝胶的制备

1.2.1 BG 溶胶凝胶溶液的制备

采用非离子型嵌段共聚物EO20-PO70-EO20（P123）制备BG 溶胶凝胶溶液。将P123（4.0 g）、正硅酸四乙酯（TEOS，6.7 g）、Ca (NO3)24H2O（1.4 g）、磷酸三乙酯（TEP，0.73 g）、0.5M HCl（1.0 g）分别溶于乙醇（60 g）中，室温搅拌1 d，得到BG 溶胶凝胶溶液。

1.2.2 Sr-BG 溶胶凝胶溶液的制备

在上述BG 配方的基础上加入0.63gSrCl2，室温搅拌1d，得到Sr-BG 溶胶凝胶溶液。

1.2.3 PVA 溶液的制备

制备质量分数为10%的PVA 溶液: 将2gPVA 溶于20mL的去离子水，加热到90℃，磁力搅拌20min，使溶液清澈透明，在室温下静置1 h，得到质量分数为10%的PVA 溶液。

1.2.4 水凝胶的制备

BG 溶胶凝胶溶液添加到PVA 溶液中，PVA 溶液与BG溶胶凝胶溶液体积比为5∶1，加热到80 ℃，磁力搅拌2 h混合均匀，充分反应得到凝胶，称为PB 水凝胶。

Sr-BG 溶胶凝胶溶液添加到PVA 溶液中，PVA 溶液与Sr-BG 溶胶凝胶溶液体积比为5∶1，加热到80 ℃，磁力搅拌2 h 混合均匀，充分反应得到凝胶，称为PB-Sr 水凝胶。

1.3 测试与表征

1.3.1 差示扫描量热法（DSC）

采用差示扫描量热仪在空气气氛下进行热分析，测试温度范围25 ～800 ℃，升温速率为10 ℃/min。通过DSC 曲线分析材料的热力学性能。

1.3.2 形貌观察

通过SEM 观察材料在PBS 溶液浸泡前后的形貌变化，对PVA、PB 和PB-Sr 表面生成的羟基磷灰石形成进行评价。在测试前，用溅射法在试样表面镀上一层薄薄的金膜。利用15 kV 的加速电压，获得了二次电子（SE）的图像。

1.3.3 pH 的变化和质量损失

将3 组材料（PVA、PB、PB-Sr）在无水乙醇介质中超声清洗、烘干，然后将支架置于盛有PBS 溶液的聚乙烯瓶中，按照PBS 溶液体积和材料质量比为100 mL/g 的比例，再将聚乙烯瓶加盖密封，置于37 ℃的烘箱内，整个过程中不更换PBS 溶液（即静态PBS 溶液浸泡）。到达预定时间2、4、6、8、10、14、28 d 后，取出材料，用pH 计测试浸泡后溶液的pH，用去离子水和无水乙醇轻轻洗涤材料3 遍，然后在37 ℃烘箱中干燥，完全烘干后称重并计算质量损失。

1.3.4 离子释放研究

水凝胶浸泡PBS 溶液2、4、6、8、10、14、28d 后溶液中的Ca、Si、Sr 元素含量用电感耦合等离子体-原子发射光谱测定。

1.3.5 X 射线衍射（XRD）

采用X 射线多晶衍射仪分析水凝胶表面的羟基磷灰石结晶情况（测试角度10 ～80°，工作电压40kV，电流40mA，扫描速度10°/min）。

1.3.6 细胞增殖性评价

水凝胶的浸提液与细胞共培养1、3、7 d 后，使用CCK-8工作液对细胞的增殖进行评估。将购置的CCK-8 原液与完全培养基以1∶10 的比例配置CCK-8 工作液，并将其避光放置。将到达时间点的孔板里的培养基用移液枪吸出，用PBS清洗后往每个孔中加入200 L 的CCK-8 工作液，并将其用锡纸包裹，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育培养1 h。然后从每孔吸取100 L 工作液加入新的96 孔板中，注意孔板中的工作液表面不能有气泡，通过酶标仪测量其在450nm 处的OD 值。

1.3.7 细胞荧光染色

使用活/死细胞试剂盒检测软骨细胞在3 种材料（PVA、PB、PB-Sr）上的生长活性。材料经75%乙醇消毒灭菌后放入96 孔板，将软骨细胞按照2×104的细胞数量种植在以上3 种材料上，放入恒温箱培养3 d。倒掉培养基，用PBS 溶液洗涤1 ～2 次，然后加入罗丹明B 和DAPI 的混合溶液至浸没材料。室温放置3 ～5 min。吸除多余染色液，用PBS溶液洗涤2 ～3 次，每次3 ～5 min。直接在荧光显微镜下观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）对多组进行比较，然后进行Tukey-Kramer 检验＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差示扫描量热法（DSC）表征

采用DSC 法对PVA、PB、PB-Sr 水凝胶的热稳定性进行评价。如图1 所示，PB 和PB-Sr 水凝胶的热分解曲线不同，有一定温度偏移。并且在480℃有一个明显的峰值，是由于PVA 和BG 发生交联，形成了杂化物。

图1 PVA、PB、PB-Sr 水凝胶的DSC 曲线

2.2 形貌观察

PBS 溶液浸泡90 d 后的水凝胶SEM 图像如图2 所示，水凝胶表面被层片状的羟基磷灰石覆盖。BG释放的Ca2+离子与PBS溶液中的PO43-离子发生反应形成羟基磷灰石。结果表明，相比PB-Sr 水凝胶，PB 水凝胶表面生成的羟基磷灰石结晶情况更佳。

图2 PVA、PB、PB-Sr 水凝胶在PBS 溶液中浸泡90 d 的SEM 图

2.3 pH 的变化、质量损失和离子释放研究

PVA、PB、PB-Sr 三组水凝胶在PBS 溶液中浸泡的质量损失和pH 变化如图3 所示。由于BG 向羟基磷灰石（HA）的转化伴随着质量的减轻，因此这些数据可以用来衡量转化动力学。3 组水凝胶的减重趋势相同，在最初的0 ～9 d 内迅速增长，之后又显著放缓，在28 d 左右趋向稳定。图3A为质量损失曲线，在任意浸泡时间段内，PB 水凝胶组的失重都高于PB-Sr 组，28 d 后PB 水凝胶降解率为25%，PBSr 水凝胶降解率为16%。图3B 为水凝胶样品浸泡在PBS 溶液下的pH 变化曲线，PB-Sr 组的pH 变化更小，说明PB-Sr组比PB 组更稳定。这是由于PVA 原料中残余的酸在降解过程中缓慢释放，导致3 组水凝胶的pH 下降。

采用电感耦合等离子体光谱仪（ICP）分析水凝胶浸泡过程中离子释放到溶液中的情况。羟基磷灰石的形成是通过消耗水凝胶释放的Ca2+和PBS 溶液释放的Ca2+、Sr2+和的累积释放量显示同样的趋势（见图3C-E）。图3D 中可见，Ca2+浓度在开始的几天内迅速上升，之后逐渐缓慢上升。

图3 PVA、PB、PB-Sr 水凝胶浸泡在PBS 溶液中28 d 内的相关参数变化:A.质量损失曲线；B.pH变化曲线；C.Sr2+离子释放曲线；D.Ca2+离子释放曲线；E.SiO32-离子释放曲线

2.4 X 射线衍射表征

图4 为PB-Sr 水凝胶在PBS 溶液中浸泡0、30、90 d 的XRD 图谱。在羟基磷灰石标准图谱Ca10(PO4)6OH2（JCPSD 72-1243）上出现特征峰，与羟基磷灰石标准图谱对应得很好。最强峰位于标准图谱的左侧[Ca10(PO4)6OH2标准谱最强峰的2 为31.773°]，表明在PBS 溶液浸泡下，水凝胶表面形成了羟基磷灰石。浸泡时间越长，其峰值越强。说明随着浸泡时间的延长，生成的羟基磷灰石结晶程度更好。从图谱中还可以看出，浸泡90 d 的PB-Sr 水凝胶的XRD 衍射峰强度高，峰型尖锐，说明得到的羟基磷灰石晶体结构完整[7]。

图4 PB-Sr 水凝胶在PBS 浸泡0、30、90 d 的XRD 图和羟基磷灰石Ca10(PO4)6OH2 标准XRD 图谱

2.5 细胞增殖能力评价

如图5 所示，培养7 d 后PB-Sr 水凝胶的OD 值为0.76±0.04，PB 水凝胶的OD 值为0.52±0.02，PVA 水凝胶的OD 值为0.45±0.04。PB 和PB-Sr 水凝胶组的OD 值均高于对照组，说明PB 和PB-Sr 水凝胶的细胞增殖水平高于对照组，表明了这两种水凝胶均无明显细胞毒性。PB-Sr 水凝胶的OD 值明显高于PB 水凝胶和PVA 水凝胶，进一步说明软骨细胞在PB-Sr 水凝胶上能更好的黏附与增殖。

2.6 细胞荧光染色

如图6 所示，软骨细胞黏附于水凝胶上生长，核形完整、无固缩、染色质均匀。在PVA、PB、PB-Sr 水凝胶上培养的细胞数量呈现依次增加趋势，PB-Sr 水凝胶上细胞数量最多表明软骨细胞在PB-Sr 水凝胶上能更好的黏附与增殖。

图5 培养在PVA、PB、PB-Sr 水凝胶上的软骨细胞增殖能力；与对照组比较*＜0.05，***＜0.001

图6 PVA、PB、PB-Sr 水凝胶在罗丹明B 和DAPI 下的细胞荧光染色，蓝色部分采用DAPI 对细胞核染色，红色部分采用罗丹明B 对细胞质染色，紫红色部分为两者叠加图像

3 讨论

锶是人体牙齿和骨骼中天然存在的元素，具有良好的促骨修复性能。大量研究结果表明，锶参与骨的形成，具有刺激骨形成和抑制骨吸收的作用[8]； 锶可预防骨丢失，改善骨代谢，增加骨质疏松动物的骨质量[9]； 同时，低浓度的锶还可促进骨基质的合成及成骨细胞的成熟和矿化，有利于骨骼重建和骨小梁数量的增加[10-11]。Terra 等[12]报道锶能增强磷酸钙的骨传导性能，提高骨组织的力学性能。Bonnelye 和Marie 等[13-14]研究发现，锶能促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞的形成和吸收。另外，相关研究表明，锶还具有促进软骨修复的性能: Marie 和Yu 等[15-16]报道在骨关节炎治疗中，锶在减少软骨退化和减少软骨细胞凋亡方面起着至关重要的作用。沈宇辉等[17]的研究表明，锶离子可通过激活缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF）信号通路，诱导软骨的增殖，维持其表型；通过作用激活软骨细胞自噬作用，抑制细胞降解代谢活动及印度刺猬蛋白（Indian hedgehog，IHH）信号通路保护软骨细胞。

本研究发现，在PB 水凝胶的基础上引入锶元素（PBSr）可促进形成新的化学键，进而提高材料的化学稳定性。DSC 结果显示（见图1），PB-Sr 相比PB 水凝胶在480 ℃有峰的偏移，说明材料结构发生了变化。浸泡实验中的质量损失和pH 改变（见图3 A、图3B）说明PB 和PB-Sr 水凝胶均具有较好的降解性能。其中PB-Sr 的降解速率较慢，表明其化学稳定性更高，与DSC 分析结果一致。PB 和PB-Sr 的质量损失和pH 变化在开始浸泡后的初始阶段均有大幅度的上升，随着浸泡时间的增加逐渐趋缓。这是由于试样表面积累的羟基磷灰石层逐渐阻碍了降解反应，导致pH 变化率和质量损失率随时间呈减缓趋势。锶离子属于碱性离子，被释放时会增加局部环境的pH[18]，所以PB-Sr 组的pH 最高。PB 和PB-Sr 组的pH 均高于PVA 组，因为BG 中的CaO 等组分溶于溶液中释放Ca2+离子，与水中的羟基发生反应，生成碱性的Ca (OH)2，从而抵消一部分由PVA 自带的酸性原料使pH 下降的影响。离子释放曲线（见图3C-E）表明，材料能释放出促进软骨修复的钙离子和锶离子。钙离子浓度的快速增加是由于水凝胶降解导致离子快速释放所致，然后形成的羟基磷灰石消耗钙离子导致钙离子浓度增长缓慢。Sr2+和SiO32-则逐步缓慢释放。SEM 结果（见图2）和XRD 结果（见图4）也证明了羟基磷灰石的生成，并且随着浸泡时间的增加，羟基磷灰石结晶更完整。

细胞增殖结果（见图5）和荧光染色结果（见图6）表明，PB 水凝胶可促进软骨细胞的增殖，锶元素的引入则能进一步增强细胞增殖效果。Henrotin 与Alexandersen 研究发现，锶元素可通过刺激关节软骨细胞合成代谢增加软骨基质的形成[19]并可降低Ⅱ型胶原降解生物标记物CTX-Ⅱ的水平，进而减少软骨退变[20]。Deng 等[21]报道锶离子通过激活Wnt 通路刺激软骨重建，促进软骨下骨再生，并通过抑制软骨细胞代谢活性和增加自噬来进一步保护软骨细胞免受骨关节炎的损伤。

对生物活性玻璃（BG）和掺锶生物活性玻璃（Sr-BG）与PVA 制备的复合水凝胶进行相关性能研究，探索水凝胶浸泡在磷酸盐缓冲液（PBS）中的可降解性能、离子释放性能和结构变化，以及体外促软骨细胞增殖能力评价。笔者的研究结果表明，PB 和PB-Sr 水凝胶具有良好的生物活性和降解性能，同时两种水凝胶均可以促进软骨细胞的增殖分化，可望用于修复受损软骨。PB 和PB-Sr 水凝胶均无明显的细胞毒性，其中掺杂锶元素后能更好地促进软骨细胞增殖与黏附，有效帮助软骨组织修复再生。然而该材料在体内的降解吸收情况和体内修复关节骨软骨损伤的效果还有待进一步研究，以期为临床应用提供更多依据。