地胆粉酶解前后蛋白质含量测定及正交优化实验

王娅玲　王悦　于佩琳　徐凯旋　陶然　韩金哲　高世杰

摘      要：结合超声法比较酶解前后地胆粉中蛋白质含量的变化，并用正交实验法优化酶解后地胆粉中蛋白质的提取工艺，为今后地胆粉进一步研究提供实验依据。首先，采用胰蛋白酶进行酶解，Lowry法测定酶解前后的蛋白质含量，将酶解与超声法结合，与酶解前进行对比;之后，通过设计不同种类的酶、酶解时间、酶的用量，对地胆粉中蛋白质的提取工艺进行优化。实验表明地胆酶解前的蛋白质含量少于酶解后的蛋白质含量，酶解前采用水提法测定的质量浓度为24.71 mg·mL^-1，胰蛋白酶酶解后蛋白质质量浓度测定为48.32 mg·mL^-1，正交优化地胆的最佳酶解工艺为胰蛋白酶用量为2.5 mg、酶解时间为3.5 h。

关  键  词：地胆;酶解;含量对比;蛋白质;正交实验

中图分类号：TQ 937       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）07-1333-04

Protein Content Determination and Orthogonal Optimization Experiment Before and After Meloecoarctatus Motschulsky Powder Enzymolysis

WANG Ya-ling， WANG Yue， YU Pei-lin， XU Kai-xuan， TAO Ran，，HAN Jin-zhe，GAO Shi-jie

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract：The change of protein content in Meloecoarctatus Motschulsky powder before and after enzymolysis was compared with ultrasound method， and the extraction process of protein in Meloecoarctatus Motschulsky powder after enzymolysis was optimized by orthogonal experimental method， which could provide experimental basis for further study of Meloecoarctatus Motschulsky powder in the future. At first，the enzymolysis was carried out by trypsin enzymes，and the protein contents before and after the enzymolysis were determined by Lowry method.And then taking enzyme types， enzymolysis time， enzyme dosage as influence factors， the extraction process of protein in Meloecoarctatus Motschulsky powder was optimized，the optimal extraction process was determined. The results showed that the protein content before enzymolysis was less than the protein content after enzymolysis， the content of hydropitimite determination before enzymolysis was 24.71 mg·mL-1， the protein content after enzymolysis was 48.32 mg·mL-1， the best enzymolysis process was as follows： trypsin enzyme 2.5 mg， enzymolysis time 3.5 h.

Key words： Meloecoarctatus Motschulsky powder; Enzymolysis; Content comparison; Protein; Orthogonal experiment

地膽与斑蝥同为芫菁科昆虫，主要成分均为斑蝥素^[1]。目前研究主要集中于斑蝥身上，对其同属动物地胆的研究较少。近年来斑蝥素的抗癌作用备受重视，随着癌症患者数量的增加，对斑蝥素的需求也逐渐上升，导致其供不应求^[2]，因此对于其同属昆虫的开发越来越重要。

地胆为常用动物药，始于《神农本草经》，又名芫青，功用与斑蝥相似，更长于疝积止痛、除疮中恶肉。地胆有大毒，性猛峻裂^[3]，副作用较大，经研究其毒性成分斑蝥素对原发性肝癌、膀胱癌等具有显著抑制作用^[4]，可阻碍肿瘤细胞繁殖，减少不良反应，制备抗肿瘤新药。

酶法为近年来的研究热点，生物酶能破坏细胞壁，加速有效物质溶出，因其专一性而受到广泛欢迎。为确定酶解对动物类药物的影响，本实验将酶解与超声法结合，与酶解前进行对比，通过设计不同种类的酶、酶解时间、酶的用量对地胆粉中蛋白质的提取工艺进行优化^[5]，确定最佳提取工艺。

1  实验部分

1.1  药材

地胆粉，实验室自制，经鉴定为正品。

1.2  试剂^[6]

胃蛋白酶，甘氨酸，弹性蛋白酶，福林酚试剂，胰蛋白酶等，皆为分析纯。

1.3  仪器^[7]

恒温水浴锅，电子天平，超声波清洗器，高速冷冻离心机。

2  实验方法

2.1  蛋白质标准曲线的测定

精密称取甘氨酸100 mg，边超声边搅拌溶解，定容至容量瓶中。用移液枪再次移取稀释，配制为不同浓度的甘氨酸溶液于干燥的试管中，向待测溶液加入5 mL的碱性铜试剂，振荡，放置一段时间，随后加入福林酚溶液，静置，0.5 h后测定甘氨酸标准溶液的吸光度^[8]。

2.2  酶解前后蛋白质含量测定

称取地胆1.00 g溶于蒸馏水，离心抽滤，参照“2.1”项下水提法测定酶解前地胆粉中蛋白质的吸光度，计算蛋白质含量;另取地胆1.00 g，制备相同条件下的酶解液，离心抽滤，参照“2.1”项下方法测定酶解前地胆粉中蛋白质的吸光度^[9]。

2.3  单因素实验

2.3.1  酶的种类对地胆提取影响

固定酶解时间为3.5 h，酶的用量均为2.5 mg，分别用胃蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解地胆粉，测定酶解后地胆的吸光度，计算不同酶酶解地胆粉的蛋白质含量差异。

2.3.2  酶解时间对地胆提取影响

固定酶的种类为胰蛋白酶，酶的用量均为2.5 mg，酶解时间分别为2.5、3、3.5、4、4.5 h，测定酶解后的吸光度，考察不同酶解时间后地胆粉的蛋白质含量差异

2.3.3  酶的用量对地胆提取影响

固定酶的种类为胰蛋白酶，酶解时间为3.5 h，选择酶的用量分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg，测定吸光度，比较酶的用量对地胆粉蛋白质含量的影响。

2.4  正交实验

见表1，取酶的用量、种类、酶解时间3个因素设计正交优化实验。

3  实验结果

3.1  标准曲线测定

如图1所示，实验测得甘氨酸标准曲线为：

y=0.677 1x+0.013 9，R²=0.998 2。

3.2  酶解前后比较

如图2所示，酶解前地胆中蛋白质的吸光度为0.181 2 Abs，经计算得含量为24.71 mg·mL^-1;酶解后地胆中蛋白质的吸光度为0.341 1 Abs，含量為48.32 mg·mL^-1。酶解后地胆粉中蛋白质的含量明显多于未经酶解的蛋白质含量，说明经过酶解地胆中的蛋白质能够提取更充分。

3.3  单因素实验

3.3.1  酶的种类对地胆提取影响

由图2所示，用4种不同酶酶解地胆粉，所测木瓜蛋白酶的吸光度最低，其他3种酶酶解地胆粉的效果均好于木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与人体蛋白酶不同，最适作用温度为65 ℃，常温下酶的活性较低，难以发挥最佳酶解作用，因此进行正交优化实验时排除木瓜蛋白酶对地胆酶解的影响。

3.3.2  酶解时间对地胆提取影响

本次实验酶解时间取值范围为2.5～4.5 h，吸光度代表蛋白质酶解效果呈现先上升后下降的趋势，酶解时间为3.5 h时，地胆粉酶解蛋白质的效果最佳，随着酶解时间的增加逐渐呈现下降趋势，酶解时间过长可能存在蛋白质流失情况，提取效率降低，见图3。

3.3.3  酶的用量对地胆提取影响

在加酶量为1.5～2.5 mg时，酶解效果随用量的增加而增加，胰蛋白酶与地胆粉的接触面积增

大^[10]，酶解程度显著升高，加酶量大于2.5 mg时，排除实验误差的影响，胰蛋白酶与底物的接触面积变小^[11]，蛋白质酶解效果稍有降低，见图4。

3.4  正交实验结果

参考单因素实验结果，设计酶解地胆粉不同因素不同水平的交叉实验，计算出不同水平下酶解地胆粉的蛋白质含量，优选最佳酶解工艺，结果见表3^[12]。

从表4可知，对正交法酶解地胆粉优化实验进行结果分析，由F值比较可知，酶的种类（A）、酶解时间（B）、酶的用量（C）对地胆粉酶解实验的作用程度为酶解时间>酶的种类>酶的用量，地胆粉酶解受时间影响最大，酶的种类对测定地胆粉中蛋白质的影响弱于酶解时间，酶的用量影响最弱。结合P值分析，P_B>P_A>P_C，P_A、P_B值均小于0.05，对地胆粉酶解影响极为显著，为主要影响因素;0.05<P_C<0.1，影响也较为显著。

4  结束语

许多动物类中药毒性较大，如全蝎、蟾酥、蕲蛇等，药用历史悠久，药物有毒成分即为其有效成分^[13]。蟾蜍解毒、开窍效果较好^[14]，能够抑制白细胞增加，增强免疫力，对于白血病、肿瘤具有一定的治疗效果;蜈蚣药用历史悠久，性温有毒，其攻坚散结、治疗顽症疗效极为显著^[15]，现多用于肿瘤前期治疗、活血化瘀、抗菌抗炎等^[16];全蝎蝎毒近年来为研究热点，为攻坚散结的常用药^[17]，定惊作用较好，深入研究表明全蝎蝎毒镇痛作用较好，能够缓解疼痛，疗效显著。

本实验采用胰蛋白酶进行酶解，Lowry法测定酶解前后的蛋白质含量，将酶解与超声法结合，与酶解前进行对比，通过设计不同种类的酶、酶解时间、酶的用量对地胆粉中蛋白质的提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺。结果表明：地胆酶解前的蛋白质含量少于酶解后的蛋白质含量，酶解前采用水提法测定的含量为24.71 mg·mL^-1，胰蛋白酶酶解后蛋白质含量测定为48.32 mg·mL^-1，最終确定正交优化地胆的最佳酶解工艺为胰蛋白酶用量为2.5 mg、酶解时间为3.5 h。

参考文献：

[1]李晓飞，娄方明，等.芫菁内斑蝥素和结合斑蝥素抗肿瘤活性的比较研究[J].时珍国医国药，2013，24（3）：535-538.

[2]王腾蛟.绿芫菁成分定性分析、斑蝥素含量测定及斑蝥素与其衍生物抗肿瘤活性研究[D].南宁：南宁师范大学，2018.

[3]刚宏林，赵文静，张乔.有毒动物药的现代药理作用研究概况[J].中医药信息，2005，22（5）：44-47.

[4]范潇婷，于睿鹏，董瑞娟，等.斑蝥素及去甲斑蝥素对小鼠毒性靶器官的影响[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（15）：118-123.

[5]师婷婷.生物酶与超滤纯化在枸杞多糖和总黄酮提取中的应用研究[D].兰州：甘肃中医药大学，2016.

[6]吕迎兰，田玉婷，毛会秀，等.正交实验法优化地龙粉混合酶酶解工艺[J].当代化工，2019，48（6）：1174-1177.

[7]方园，郭鹏川，刘小玉，等.超声-酶联半仿生法优化海参的水提工艺及体外抗肿瘤活性研究[J].华西药学杂志，2019，34（4）：388-392.

[8]刘春雨，张盼盼，王颖，等.蜈蚣粉酶解工艺最佳用酶的初步筛选[J].中南药学，2017，15（6）：759-762.

[9]王娅玲，刘迪，毛会秀，等.地胆粉最佳用酶及其酶解物的抗肿瘤作用研究[J].当代化工，2019，48（7）：1445-1448.

[10]李玉昕，朱迎春，卫云云，等.响应面试验优化牛骨汤酶解工艺及其钙含量分析[J].食品研究与开发，2020，41（3）：92-96.

[11]孔露，孔茂竹，余佳熹，等.响应面优化碱性蛋白酶法提取藜麦淀粉工艺[J].食品研究与开发，2020，41（2）：100-106.

[12]王舒玉，曹广超，林伟江，等.正交试验法优化发酵蜣螂粉中水溶性蛋白的提取工艺[J].当代化工，2018，47（11）：2334-2337.

[13]王诺琦，张莉，杨秀颖，等.动物类有毒中药“毒”的历史认识及现代研究[J].医药导报，2019，38（11）：1425-1430.

[14]张静，李晶峰，杜延佳，等.近5年动物药药理研究新进展[J].吉林中医药，2016，36（11）：1136-1137.

[15]杨晓慧，李雁.中药蜈蚣抗肿瘤的研究进展[J].中成药，2017，39（2）：373-377.

[16]张乔，刘东，赵子佳，等.蜈蚣有效成分提取分离及药理作用研究进展[J].吉林中医药，2016，36（12）：1244-1246.

[17]史磊，张天锡，杜聪颖，等.中药全蝎活性成分、药理作用及临床应用研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2015，17（4）：89-91.

基金项目：山东省重点研发计划（项目编号：2016GSF202003）;山东中医药大学优秀青年基金（项目编号：2018zk34）。

收稿日期：2020-02-26

作者简介：王娅玲（1998-），女，山东省烟台人，2021年毕业于山东中医药大学，研究方向：中药学。E-mail：2234383235@qq.com。

通讯作者：高世杰（1977-）， 男， 副教授，博士，研究方向： 中药活性成分的分析。E-mail：sys209@ 163.com。