牦牛乳与荷斯坦牛乳硬质干酪的抗氧化特性比较

杨 静,梁 琪,宋雪梅,张 炎

（甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃省功能乳品工程实验室,甘肃 兰州 730070）

干酪是一种风味独特、营养丰富、耐贮性良好的发酵性乳制品,是乳品营养物质的浓缩[1-2]。硬质干酪是国际乳品工业加工中主要干酪品种,需要数月甚至两年的成熟期进行风味的积累,这是一个相当复杂的微生物及生化变化过程。在成熟过程中,脂肪氧化降解形成氧化降解产物,这些氧化降解产物很大程度上决定干酪的品质。在成熟期干酪中本身存在一些天然抗氧化因子,它们具有很强的抗氧化作用,能够使整个体系的氧化程度降低,这可能也是硬质干酪成熟期较长的一个重要原因。Batool等[3]在研究中发现,VE和硒能提高切达干酪的抗氧化能力,并且能阻遏其发生脂质氧化；曲秀伟[4]的研究表明切达干酪在益生菌的作用下能够产生具有抗氧化活性的小分子多肽；Liu Lu等[5]研究普通全脂牛乳切达干酪水溶性提取物的抗氧化活性,发现随成熟时间的延长,该提取物表现一定的抗氧化特性。这些结论验证了干酪中抗氧化因子在脂质氧化过程中的重要性。

Giannoglou等[6]研究指出降低干酪脂肪含量导致成熟过程中脂肪参与代谢积累的挥发性风味化合物的种类和数量减少。O'mahony等[7]研究还发现使用脂肪粒径和孔隙较大的乳制成的干酪,成熟过程中氧化较为迅速且游离脂肪酸含量显著较高。Ewe等[8]研究发现经过发酵后的乳脂肪生物活性物质（如抗氧化物质）的含量更高。Murtaza等[9]研究表明,不同种源牛乳脂肪的种类和数量存在较大的差异,不同来源的牛乳脂肪氧化程度有显著差异,牦牛乳脂质、蛋白质和干物质含量均高于其他普通牛乳,利用牦牛乳制成的硬质干酪其脂质、蛋白质和干物质含量也高于普通牛乳制成的硬质干酪,其营养价值和风味也不同。Revilla等[10]通过研究山羊乳、母羊乳和牛乳制成的干酪,发现不同乳源的干酪中其抗氧化能力有显著差异,且不同原料制成的干酪其抗氧化能力与脂肪和蛋白质含量均呈现正相关。Perna等[11]对意大利棕色牛乳干酪和荷斯坦牛乳干酪进行研究,发现意大利棕色牛乳干酪比荷斯坦牛乳干酪具有更高的抗氧化活性,并且两种干酪的抗氧化活性在干酪成熟期间都有所增加。

牦牛作为青藏高原特有的品种,放牧环境使牦牛乳营养物质和天然抗氧化成分含量与普通牛乳有明显差异,抗氧化物质对硬质干酪成熟过程中的氧化稳定性具有重要的作用。牦牛乳硬质干酪在成熟过程中乳脂含量与乳脂氧化速率呈现的规律鲜有报道。本实验以甘肃天祝县抓喜秀龙乡牦牛乳和甘肃农业大学奶牛场荷斯坦牛乳为原料制作硬质干酪,分别测定成熟期6 个月内（0、1、2、3、4、5、6 个月）脂肪氧化程度并探讨其变化规律。通过测定酸度值（acidity value,ADV）、羰基价（carbonyl value,CV）、过氧化值（peroxide value,POV）和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）值,比较牦牛乳硬质干酪和荷斯坦牛乳硬质干酪在成熟期间脂肪氧化的程度与速率,探讨硬质干酪乳脂含量与氧化速率的规律,以期为乳脂氧化机理的研究提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牦牛乳采自甘肃天祝县抓喜秀龙乡；新鲜荷斯坦牛乳采自甘肃农业大学奶牛场。

小牛皱胃酶（活力为10万单位/g） 兰州百灵生物技术有限公司；发酵剂（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）丹麦丹尼斯克公司；实验所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5100分光光度计 上海光谱仪器有限公司；pHS-3C酸度计 上海精密仪器有限公司；RE52-98旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；TGL-20高速离心机长沙平凡仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硬质干酪的加工

新鲜原料乳经检验合格后分装,经巴氏杀菌后冷却至35 ℃,随即加入已活化的发酵剂,大约1 h后测其pH值,当pH值降至6.2时缓慢加入0.3 g/L CaCl2并慢速搅拌,10 min后加入0.67 g/L凝乳酶,2 h后利用乳酸降酸至pH 5.6,切割、排乳清,加入2%凝块质量的食盐、堆酿约2 h、放入压榨槽内进行压榨并包装,置于4 ℃恒温冰箱中分别成熟0、1、2、3、4、5、6 个月,待成熟后进行各项指标的测定。

1.3.2 干酪出品率及脂肪含量的测定

1.3.2.1 干酪出品率的测定

分别称量鲜奶、鲜干酪（即成品干酪）以及发酵剂质量,按照式（1）计算干酪出品率。

1.3.2.2 乳脂质量分数的测定

采用GB/T 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中测定方法。称取干酪样品2 g,加入8 mL水混匀,加入10 mL 2 mol/L盐酸溶液,在70～80 ℃水浴条件下消化完全。加入10 mL无水乙醇混匀,冷却后分次加入25 mL无水乙醚,振摇1 min后静置12 min,再次用无水乙醚冲洗附着在容器上的脂肪,静置20 min,吸取上清液于已恒质量的锥形瓶中,再次用5 mL无水乙醚洗涤容器,振摇后静置,将乙醚层吸出与之前乙醚层合并,水浴蒸干,再于（100±5）℃下干燥1 h,置于干燥器内冷却,恒质量后称量。样品的乳脂质量分数按式（2）进行计算。

式中：m1为恒质量后接收瓶和脂肪的质量/g；m0为接收瓶的质量/g；m2为样品的质量/g。

1.3.3 氧化指标的测定

1.3.3.1 ADV的测定

采用Katsiari等[12]的方法并加以改进。称取干酪样品,加入石油醚-乙醇（2∶1,V/V）混合液,均质,过滤,加入酚酞指示剂,用0.1 mol/L氢氧化钾-乙醇标准溶液滴定至终点。样品的ADV按式（3）进行计算。

式中：ADV为中和1 g干酪样品中游离脂肪酸所需氢氧化钾的质量,单位mg/g；V为干酪样品消耗氢氧化钾标准溶液的体积/mL；c为氢氧化钾-乙醇标准溶液的浓度/（mol/L）；m为干酪样品的质量/g。

1.3.3.2 CV的测定

采用GB/T 5009.230—2016《食品安全国家标准 食品中羰基价的测定》中测定方法。称取干酪样品,加入5 mL精制苯溶液溶解样品,再分别加入3 mL三氯乙酸溶液和5 mL 2,4-二硝基苯肼溶液并摇匀。置于60 ℃水浴中30 min,冷却后缓慢加入0.05 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液,摇匀后放置10 min。用不加样品的空白试剂调零分光光度计,于440 nm波长处测吸光度。干酪样品的CV按式（4）进行计算。

式中：A为干酪样品溶液的吸光度；m为干酪样品的质量/g。

1.3.3.3 POV的测定

参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》的测定方法,并加以改进。称取干酪,加入冰乙酸与异辛烷混合溶液（6∶4,V/V）50 mL,混匀,准确量取饱和碘化钾溶液0.5 mL,振摇,放置暗处3～5 min后立即加入30 mL蒸馏水摇匀,用0.002 mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色,准确量取10 g/L淀粉溶液0.5 mL,溶液变为蓝色,继续用硫代硫酸钠标准溶液滴定至蓝色消失。同时不加样品做空白实验。干酪样品的POV按式（5）进行计算。

式中：V为滴定干酪样品所消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积/mL；V'为滴定空白组试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积/mL；c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度/（mol/L）；m为干酪样品的质量/g。

1.3.3.4 TBA值的测定

采用Aryee[13]和Salih[14]等的方法,并加以改进。称取三氯乙酸7.5 g、乙二胺四乙酸0.1 g,用蒸馏水溶解并定容至100 mL待用,称取干酪样品,水浴条件下加入上述混合液50 mL,均质5 min,用双层滤纸过滤两次。取滤液5 mL,加入TBA溶液,90 ℃水浴40 min,冷却后离心,取上清液并加入三氯甲烷,分层,取上清液分别于532 nm和600 nm波长处测定吸光度,以不加样品的空白试剂调零。干酪样品的TBA值按式（6）进行计算。

式中：A532nm为样液在532 nm波长处的吸光度；A600nm为样液在600 nm波长处的吸光度。

1.4 数据处理与分析

采用Excel软件进行数据处理,各项指标的结果均采用3 次重复,以平均值±标准差表示,用SPSS 19.0软件进行显著性分析（Duncan法）。

2 结果与分析

2.1 干酪乳脂质量分数及出品率

表1 不同乳源干酪乳脂质量分数及出品率Table 1 Yield and fat content of cheese made from different milk sources

原料乳、凝乳酶和发酵剂的类型和添加量以及CaCl2的添加量对干酪的产量、品质等具有重要影响[15]。牦牛乳和荷斯坦牛乳硬质干酪乳脂质量分数分别为（49.96±2.48）%和（29.86±2.16）%,出品率分别为（19.76±0.18）%和（12.10±0.10）%（表1）。牦牛乳硬质干酪的乳脂质量分数比荷斯坦牛乳硬质干酪高出17.10%,出品率是荷斯坦牛乳硬质干酪的1.63 倍。研究发现,牦牛乳中蛋白质、乳脂肪及干物质含量均高于荷斯坦牛乳,并且脂肪球粒径也更大。高婉伟等[16]研究得出牦牛乳的脂肪含量为7.01 g/100 g、蛋白质含量为5.24 g/100 g、干物质含量为17.86 g/100 g；荷斯坦牛乳脂肪含量为3.40 g/100 g、蛋白质含量为3.40 g/100 g、干物质含量为12.75 g/100 g。钟光辉等[17]研究得出的牦牛乳脂肪球粒径（4.39 μm）远大于王风梅等[18]研究得出的荷斯坦牛乳脂肪球粒径（3.16 μm）,脂肪球粒径越大,其乳脂含量相对较高,干酪的出品率越高[18]。

2.2 成熟期内乳脂肪游离脂肪酸ADV和CV的变化

2.2.1 游离脂肪酸ADV的变化

表2 不同乳源干酪成熟期间ADV变化Table 2 Changes in ADV of cheese made from different milk sources during ripening

ADV反映游离脂肪酸的含量,用来判断干酪中脂肪的水解程度。ADV在干酪成熟期间的变化如表2所示。两种干酪在成熟过程中ADV均呈现增大趋势,干酪在成熟过程中脂肪的水解不断进行。Amer等[19]研究也发现乳中存在的天然乳脂蛋白脂酶会催化乳脂肪分解并引起游离脂肪酸水平的显著增加。0 个月时,牦牛乳硬质干酪与荷斯坦牛乳硬质干酪ADV分别为1.71 mg/g和1.30 mg/g,成熟6 个月时,牦牛乳硬质干酪ADV为6.24 mg/g,略高于荷斯坦牛乳硬质干酪ADV（6.04 mg/g）（P＞0.05）。通过拟合线性回归方程分别得出两种干酪在成熟期间0～6 个月ADV的线性方程,牦牛乳硬质干酪线性方程：Y＝0.756 9x+1.157 3（R2＝0.980 4）；荷斯坦牛乳硬质干酪线性方程：Y＝0.756 7x+0.470 8（R2＝0.986 8）。2.2.2 CV的变化

表3 不同乳源干酪成熟期间CV变化Table 3 Changes in CV of cheese made from different milk sources during ripening

CV代表产物过氧化物形成后进一步分解的含羰基化合物的量,是反映脂质氧化程度的重要指标[20]。由表3可知,两种干酪在成熟期间CV持续增加。当成熟期到达3 个月,牦牛乳硬质干酪CV达到0.54 meq/kg,显著高于荷斯坦牛乳硬质干酪（0.48 meq/kg）,在3 个月时牦牛乳硬质干酪中形成的过氧化物相对较多,并分解为许多含羰基化合物。两种干酪的CV在成熟过程中的变化趋势与巨玉佳等[21]研究的牦牛乳硬质干酪的变化趋势大体相近,均呈现出整体上升的状态,表明干酪在成熟期间脂肪的氧化持续进行,两种干酪在1、2、4、5、6 个月时CV之间差异不显著（P＞0.05）,而0 个月与3 个月时两种干酪间CV差异显著（P＜0.05）。通过拟合线性回归方程分别得出两种干酪在成熟期间0～6 个月CV的线性方程,牦牛乳硬质干酪线性方程：Y＝0.133 8x+0.003 9（R2＝0.967 9）；荷斯坦牛乳硬质干酪线性方程：Y＝0.131 2x-0.003 9（R2＝0.975 3）。

2.3 成熟期内乳脂肪POV的变化

表4 不同乳源干酪成熟期间POV变化Table 4 Changes in POV of cheese made from different milk sources during ripening

POV是反映脂肪氧化程度的主要指标,也是脂肪氧化初级评价指标,即一级氧化指标,是氧与不饱和脂肪酸的双键反应形成的中间氧化产物[22]。干酪在成熟期间POV变化如表4所示。两种干酪的POV在成熟初期急剧升高,牦牛乳干酪在3 个月时达到最大值（1.02 mmol/kg）,相比0 个月时的POV增加了0.62 mmol/kg,增幅约为155%；荷斯坦牛乳干酪于4 个月时达到最大值（1.01 mmol/kg）,相比第0个月时增加了0.59 mmol/kg,增幅约为140%。在干酪成熟的早期阶段,脂肪中的主要过氧化物积累,POV急剧上升。当一级产物醛酮类物质和烃类化合物的积累量与一级产物所生成的小分子物质（羧酸类化合物）的量达到一个临界点时,一级产物的积累速率降低,一级产物进一步生成小分子物质的速率加快,POV开始降低,当产生过氧化物的增加量与进一步生成小分子物质的消耗量趋于平衡时,POV逐渐趋于稳定[23]。由于牦牛乳硬质干酪的脂肪含量高于荷斯坦乳硬质干酪,牦牛乳硬质干酪的POV总体上高于荷斯坦牛乳干酪,后期（4～6 个月）牦牛乳与荷斯坦牛乳硬质干酪的POV并没有显著性差异（P＞0.05）,很可能是因为牦牛乳硬质干酪的抗氧化因子更高,阻遏了其氧化增速。通过拟合回归方程分别得出两种干酪在成熟期0～6 个月POV的拟合方程,牦牛乳硬质干酪方程：Y＝-0.001 7x5+0.038 2x4-0.336 6x3+1.347 7x2-2.146 7x+1.496 9（R2＝0.993 2）；荷斯坦牛乳硬质干酪方程：Y＝0.002 5x5-0.049 4x4+0.334 6x3-0.962 5x2+1.253 9x-0.157（R2＝0.981 1）。

2.4 成熟期内乳脂肪二级氧化程度TBA值的变化

表5 不同乳源干酪成熟期间TBA值变化Table 5 Changes in TBA values of cheese made from different milk sources during ripening

TBA值是反映脂肪进一步氧化程度的主要指标,根据TBA值可以推断干酪脂肪的二级氧化程度。成熟过程中两种干酪的TBA值变化如表5所示。在成熟6 个月时牦牛乳硬质干酪和荷斯坦牛乳硬质干酪TBA值分别为0.277 mg/kg和0.262 mg/kg。两种干酪在成熟期内TBA值均呈现较低水平,并且上升幅度不大。牦牛乳硬质干酪与荷斯坦牛乳硬质干酪的二级氧化速率在成熟3、4 个月时差异显著（P＜0.05）,在成熟5、6 个月时差异不显著（P＞0.05）。通过拟合线性回归方程分别得出两种干酪在成熟期间0～6 个月TBA值的线性方程,牦牛乳硬质干酪线性方程：Y＝0.034 3x+0.024 4（R2＝0.968 8）；荷斯坦牛乳硬质干酪线性方程：Y＝0.032 3x+0.017（R2＝0.939）。

2.5 两种干酪成熟期间各指标总增幅及平均增长速率

2.5.1 游离脂肪酸ADV和CV总增幅及平均增长速率

图1 两种干酪成熟期间ADV（A）和CV（B）总增幅及平均增长速率Fig.1 Total increments and average growth rates of ADV (A) and CV (B)in two cheeses during ripening

由图1可知,两种干酪在成熟期间各指标的总增幅不同。牦牛乳硬质干酪的ADV在0～6 个月的总增幅为263.94%,荷斯坦牛乳干酪的总增幅为363.91%,高出牦牛乳硬质干酪99.97%,牦牛乳硬质干酪的乳脂含量比荷斯坦牛乳干酪高,但是其在成熟期间ADV总增幅却比荷斯坦干酪低,其在成熟期间平均增长速率为0.754 4 mg/（g·月）,略低于荷斯坦牛乳硬质干酪的平均增长速率0.790 5 mg/（g·月）。牦牛乳干酪在成熟期间CV的总增幅为455.22%,荷斯坦干酪为524.56%,两种干酪CV平均增长速率分别为0.140 0 meq/（kg·月）和0.138 5 meq/（kg·月）,由此可以看出两种干酪CV的平均增长速率相差不明显,并且牦牛乳干酪在3～6 个月的增幅为87.58%,而荷斯坦牛乳干酪为108.54%,出现了后期增幅降低的情况。

2.5.2 一级氧化程度POV和二级氧化程度TBA值总增幅及平均增长速率

由图2可知,牦牛乳干酪和荷斯坦牛乳干酪在成熟期间POV总增幅分别为33.63%和12.86%,POV平均增长速率分别为0.022 3 mmol/（kg·月）和0.008 3 mmol/（kg·月）,牦牛乳干酪的总增幅和平均增长速率均高于荷斯坦牛乳,但是在6 个月时,牦牛乳干酪和荷斯坦牛乳干酪POV差异不显著（表4）,这就说明在6 个月时,两种干酪的氧化程度大体是一致的,并且在3～6 个月时,牦牛乳POV的增幅为-48.03%,而荷斯坦干酪为-40.17%,明显较牦牛乳干酪POV降幅较缓；TBA值在成熟期间牦牛乳硬质干酪的总增幅为330.48%,荷斯坦牛乳干酪为335.89%,牦牛乳和荷斯坦牛乳干酪的平均增长速率分别为0.035 4 mg/（kg·月）和0.033 6 mg/（kg·月）,平均增长速率大体相当,两种干酪在3～6 个月时的总增幅分别为54.68%、91.82%,牦牛乳干酪依旧呈现一个后期低增长和低速率的趋势。

图2 两种干酪成熟期间POV（A）和TBA值（B）总增幅及平均增长速率Fig.2 Total increments and average growth rates of POV (A) and TBA value (B) in two cheeses during ripening

总体来说,牦牛乳硬质干酪的乳脂含量较荷斯坦牛乳硬质干酪高,但是其在成熟期间的平均氧化速率和总增幅却比荷斯坦牛乳硬质干酪低。值得注意的是牦牛乳硬质干酪在0～3 个月CV、POV、TBA的增长速率和增幅均比荷斯坦高,但是在3～6 个月,这3 个氧化指标的增幅和速率却较荷斯坦牛乳硬质干酪低,这就说明牦牛乳硬质干酪后期的氧化慢于荷斯坦牛乳干酪。结合国内外文献,造成这种现象的主要原因是牦牛乳干酪比荷斯坦牛乳干酪中存在更多的抗氧化因子。其中乳中自带的一些抗氧化成分如维生素（包括核黄素、视黄醇、生育酚、胡萝卜素等）[24]、多肽、脂肪酸等生物活性物质[25]、抗氧化酶（包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等）[26],还有一些极性脂质（如磷脂等）起到重要的抗氧化作用[27]。Suo Huayi等[28]研究得出乳源性抗氧化物质具有阻止自由基生成、清除已形成的自由基和活性氧的功能。乌仁图雅等[29]研究发现乳通过发酵后可以进一步促进抗氧化物质的释放,而发酵产生的一些衍生物不仅可以清除自由基,还可以提高细胞中过氧化氢酶活性和谷胱甘肽的水平,这使得干酪的抗氧化活性远高于液态乳。Revilla[10]与Lucas[30]等研究发现,干酪的抗氧化能力与某些抗氧化物质（蛋白质、视黄醇、矿物质、VA、VE、β-胡萝卜素）的含量呈正相关,并且得出干酪的抗氧化能力与乳脂含量呈正相关,即乳脂含量越多,其中所含的脂溶性抗氧化物质也更多,干酪的抗氧化性能更加显著。Revilla等[31]发现脂溶性抗氧化物质的含量与动物的饲养方式也有着密不可分的关系,饲喂或者放牧食用新鲜牧草的动物比饲喂饲料的动物乳脂中所含脂溶性物质丰度更高。Songisepp等[32]发现益生菌干酪的抗氧化活性随成熟时间的延长呈现增加趋势。由此可见,牦牛乳干酪中所含的脂溶性抗氧化物质丰度可能更高,牦牛乳干酪成熟后期的氧化速率慢,主要是这些抗氧化物质在成熟的后期起到了关键性的作用。本实验发现牦牛乳硬质干酪的乳脂氧化呈现高乳脂低氧化现象,为进一步揭示其影响因子和机理提供参考。

3 结 论

本研究比较了牦牛乳与荷斯坦牛乳硬质干酪的抗氧化特性,结果发现,牦牛乳硬质干酪中乳脂含量虽高,但是在整个成熟期间牦牛乳硬质干酪氧化指标总增幅和平均增长速率较荷斯坦牛乳硬质干酪小,说明牦牛乳硬质干酪在整个成熟期间脂肪的氧化速率较荷斯坦牛乳硬质干酪慢,这是因为牦牛乳硬质干酪中含有较多的抗氧化因子。在后期3～6 个月时,牦牛乳硬质干酪乳脂氧化总增幅低于荷斯坦牛乳硬质干酪,且在6 个月时两种硬质干酪的氧化指标差异均不显著,这是由于在干酪成熟后期,这些抗氧化因子发挥了极其重要的作用。在整个成熟过程中高乳脂含量的牦牛乳硬质干酪并未呈现出较荷斯坦牛乳干酪氧化程度高的规律,这为后期的研究和牦牛乳硬质干酪贮藏品质的调控提供了参考。