钠通道Nav1.8 在瑞芬太尼诱发大鼠痛觉过敏中的作用

阮家信 蓝雨雁（通讯作者）

（广西医科大学第一附属医院麻醉科 广西 南宁 530021）

瑞芬太尼在临床麻醉中广泛应用，但存痛觉过敏副作用[1]。Nav1.8 通道在痛性刺激的外周敏感化中起效应。因此Nav1.8 可能成为防治慢性疼痛及炎性导致的痛过敏化的新途径。通过对诱发痛过敏的大鼠模型使用Nav1.8 拮抗剂（A 803467）及罗哌卡因处理，研究大鼠的背根的神经节（即DRG）的Nav1.8 通道于瑞芬太尼及切口痛模型中导致痛过敏化时的潜在功能。

1.资料与方法

1.1 实验试剂和仪器

瑞芬太尼（湖北省宜昌人福药业）、0.75% 罗哌卡因（阿斯利康）、Na+通道拮抗剂（西格玛奥德里奇）、手术器械（广西博仁生物）。

1.2 实验动物及分组切口痛模型建立

雄性SD 大鼠260 ～320 g48 只（本校动物中心）。随机分6 组： C 组静脉泵注0.9%生理盐水；RIA 组、RA 组静脉注射A-803467，10 min 后RIA 组行切口痛手术，RA 组、RIA 组静脉泵注瑞芬太尼；R 组、RI 组静泵瑞芬太尼，持续2 h，同时RI 组行手术。RIL 组经腰椎3 ～4 间隙注射罗哌卡因后，泵注瑞芬太尼2h，行手术。按Brennan TJ[2]等建立大鼠切口疼痛模型。分别测各组大鼠热痛阈：未置管T0，未给药T1，给药时间0.5 小时(T2)、1 小时(T3)、2 小时(T4)及停药后0.5 小时(T5)，各时间点分别测量各组热痛觉阈值。

1.3 RT-PCR 法检测大鼠DRG 内Nav1.8 mRNA 表达

提鼠DRG 的总RNA，并用逆转录试剂盒合成cDNA，PCR 扩增产物。

引物序列：

Nav1.8 通道：

上游：5'-GGACTCCCTGAAGACCAATATGGAAG-3'

下游：5'-GCATTGAGCTAGATGGGTTAATGTTG-3'

β-actin：

上游：5'-AGATGTACGTAGCCATCC-3'

下游：5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'

反应条件：

Nav1.8：94 ℃预 变 性5min；40 循 环，92 ℃ 30s，58 ℃ 30s,72℃ 1min；72℃延伸10 min。

β-actin：94℃预变性5min；40 循环，92℃ 30s，60℃ 30s,72℃ 1min；72℃延伸10min。

1.5 免疫组化法检测大鼠DRG 上Nav1.8 的表达

大鼠DRG 组织置4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定，然后石蜡包埋并冰冻切片，行免疫组化染色后镜下观察。

1.6 统计学分析

数据采用SPSS16.0统计学软件分析处理，计数资料采用率（%）表示，行χ2检验，计量资料用均数±标准差（±s）表示，行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 热痛阈值

比较T0、T1 各组动物体重及热痛阈均无统计学意义。在不同时间（T4、T2、T3)，RIA、R、RI、RA 及RIL 组热痛阈较C 组明显升高。T5 时间点，RI、R、RA、RIA 组大鼠的热痛阈较C 组下降 ；RIL 组热痛阈值无显著差异；其中R 组与RI 组比较大鼠热痛阈值升高，与RA组比较热痛阈值下降，差异具有统计学意义；RI 组大鼠热痛阈值均低于RIA 组和RIL 组；RIA 组大鼠热痛阈值低于RIL 组，P＜0.05，见表1。

表1 各组大鼠不同时间点热痛觉阈值（±s）

表1 各组大鼠不同时间点热痛觉阈值（±s）

注：与C 组比较，0.05；与R 组比较0.05；与RI 组比较0.05；与RIA 组比0.05

组别 只数 T0 T1 T2 T3 T4 T5 C 8 4.19±0.21 4.03±0.25 4.13±0.93 4.09±0.15 3.95±0.36 4.06±0.49 R 8 3.70±0.18 3.69±0.46 11.34±0.72 11.09±1.15 11.21±0.90 2.41±0.15 RI 8 3.91±0.47 3.79±0.21 11.15±0.61 10.96±0.11 11.17±0.12 2.25±0.16 RA 8 4.04±0.35 3.98±0.19 12.07±0.12 12.10±0.42 12.15±0.14 2.64±0.11 RIA 8 3.93±0.17 3.82±0.28 11.32±0.16 10.97±0.32 11.15±0.19 2.55±0.26 RIL 8 3.82±0.28 3.70±0.51 16.00±0.00 16.00±0.00 11.61±0.09 3.99±0.87

2.2 Nav1.8mRNA 与蛋白表达分析

与C 组比较，RI、R 组Nav1.8mRNA 表达明显增加，RA、RIA、RIL 组Nav1.8mRNA 表达下降；其中R 组Nav1.8mRNA 表达与RI 组比较下降，与RA 组比较升高，RI 组的Nav1.8mRNA 表达高于RIA、RIL 组。Nav1.8 通道表达增高；RA、RIA、RIL 组的Nav1.8 通道表达减少；R 组Nav1.8 通道表达与RI 组比降低，比RA 组升高；RI 组Nav1.8 通道表达高于RIA、RIL 组；RIA 组Nav1.8 通道表达高于RIL 均P＜0.05，见表2。

表2 各组大鼠DRG 上Nav1.8mRNA 及蛋白表达的比较（±s）

表2 各组大鼠DRG 上Nav1.8mRNA 及蛋白表达的比较（±s）

注：与C 组比较，0.05；与R 组比较0.05；与RI 组比较0.05；与RIA组比P ＜0.05

组别 Nav1.8mRNA Nav1.8 蛋白C 1.18±0.07 0.19±0.02 R 2.91±0.43 0.44±0.08 RI 3.71±0.15 1.08±0.06 RA 0.44±0.05 0.11±0.03 RIA 0.62±0.10 0.14±0.02 RIL 0.29±0.03 0.08±0.01

3.讨论

本研究表明，静脉使用瑞芬太尼可导致大鼠切口术后痛觉过敏化。同时RT-PCR 及免疫组化结果显示，此时模型脊髓的背根神经元（即DRG）的钠离子通道Nav1.8 的mRNA 和蛋白均有升高。我们使用瑞芬太尼可加深RI 组大鼠切口痛模型术后的痛过敏现象，且切口痛大鼠模型DRG 上的Nav1.8mRNA 及蛋白的表达比R 组明显升高，说明Nav1.8 通道参与了瑞芬太尼及瑞芬太尼-切口痛相关术后痛过敏的发生及发展。我们的研究也显示，经大鼠腰3、4 间隙注射罗派卡因后瑞芬太尼-切口痛相关痛过敏效应得到明显缓解，此时测量RIL 组大鼠模型脊髓神经元DRG 上钠离子通道Nav1.8 的mRNA 及蛋白表达，呈显著下降或几乎不表达，我们推测其原理可能为：通过硬膜外隙，罗哌卡因作用于大鼠背根的钠离子通道，阻滞DRG 神经元上钠离子通道，Nav1.8 通道的表达下调，使其去极化、复极化速率减少，延长了通道不应期，降低了神经细胞兴奋性和阈值，这就阻断了来自外周的痛刺激信号传入，通过降低中枢神经细胞的过敏化，从而减少了痛过敏现象的发生[3，4，5]。本研究中，C 组的大鼠热痛阈同RIL 组的比较没有显著的差别，显示了罗哌卡因的使用阻滞了大鼠的瑞芬太尼-切口痛的术后痛过敏现象；钠通道Nav1.8 拮抗剂A-803467 的使用，也减少了大鼠瑞芬太尼-切口痛模型的术后痛过敏现象，但RIA 组依旧发生了痛过敏现象；且钠离子通道在RIL 组动物DRG 上表达很少，这就说明存在其他的非Nav1.8 的Na+通道，同时参与大鼠切口痛模型的痛过敏现象的过程。