微山湖地区宽体金线蛭的群体考察与产茧后药材质量评价△

李明玥，刘金欣，王铭昕，黄秋阳，石林春*，马莉*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 国家中医药管理局资源保护重点研究室 中药资源教育部工程中心，北京 100193；2. 友搏药业微山水蛭养殖基地，山东 济宁 277600；3. 首都医科大学 中医药学院，北京 100069

宽体金线蛭WhitmaniapigraWhitman，俗称蚂蟥，其干燥全体可作为中药材水蛭在临床上使用[1]。水蛭是我国传统的活血化瘀药，始载于《神农本草经》，药性峻猛，具有破血通经、逐瘀消癥的功效，主治血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫、跌打损伤[1]。现代研究表明水蛭具有改善血液流变学、抗凝血、抑制血栓形成、抗肿瘤等药理活性[2-14]。我国以水蛭为原料的中成药有90余种，其中脉血康胶囊、疏血通注射液、通心络片、脑血康滴丸等中成药被纳入2019年《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》。除脉血康胶囊等少数中成药明确使用日本医蛭HirudonipponicaWhitman外，多数中成药实际以宽体金线蛭入药。通常认为宽体金线蛭不含水蛭素类成分，其药用有效成分的研究一直受到关注。Zhong等[15]利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离得到分子量为8608 Da的抗凝血多肽(whitmanin)。Liu等[16]从宽体金线蛭中分离得到长度为30个氨基酸的新型抗血栓多肽(WP-30)，可选择性抑制由凝血酶诱导的血小板聚集作用。

据世界卫生组织全球疾病负担报告分析，自1990年起全球因心血管疾病致死的人数显著增长[17-19]，水蛭作为治疗心血管疾病的常用中药，其需求量逐年增加，2009—2016年进入快速增长期，价格由2009年约400元/kg上涨至1000元/kg以上[20]。捕捞野生宽体金线蛭的收入超过了一般农业生产，使越来越多的人去捕捞野生宽体金线蛭。无序、过度捕捞破坏了宽体金线蛭的可持续发展，加之工农业污染导致宽体金线蛭的生境被破坏，野生宽体金线蛭的资源储量日益减少。自2008年起，由于中成药研发和生产需求旺盛，水蛭药材的用量以每年约30 t递增[20-24]，而我国野生水蛭产量以每年15%～20%的速度递减，日益枯竭的水蛭野生资源和不断增长的生产需求形成了严重的供需矛盾，人工养殖将成为水蛭药材来源的重要补充。然而，宽体金线蛭的人工繁育技术尚不成熟，多数养殖基地以野外采集的宽体金线蛭“青年苗”进行生产，现有研究主要集中于温度等因素对宽体金线蛭幼苗生长速度的影响[25-29]、不同采收时间和炮制方法等因素对药材采收质量的影响[30-34]、养殖基地农药与重金属污染对水蛭质量的影响[35]、高温环境下生病蚂蟥的病原分析[36]等下游环节，在宽体金线蛭种蛭筛选方面尚缺乏系统研究。此外，宽体金线蛭产茧后再入水死亡率较高，养殖价值低，生产中通常将产茧后的宽体金线蛭制成药材销售，其药材质量尚缺乏系统评价标准。

微山湖是宽体金线蛭的主产区之一，历史上其产量曾占全国总产量的60%以上。本研究以微山湖地区的宽体金线蛭野生种群为研究对象进行群体考察，尝试建立宽体金线蛭种蛭筛选原则，并对产茧后药材进行质量评价，为宽体金线蛭人工养殖种蛭筛选提供科学依据，同时也为春产水蛭药材的合理应用提供参考。

1 材料

1.1 样品

实验用宽体金线蛭为2018年4月在山东省枣庄市微山湖地区渔民捕捞所得，共计1193条，经中国医学科学院药用植物研究所石林春副研究员鉴定为真蛭亚纲(Euhirudinea Lukin)无吻蛭目(Arhynchobdellida Blanchard)黄蛭科(Haemopidae Sawyer)金线蛭属(WhitmaniaBlanchard)宽体金线蛭WhitmaniapigraWhitman。所有水蛭养在装有防逃设施的塑料容器内，每隔2 d换1次水，养殖用水为经充分曝气24 h以上的自来水。

1.2 仪器和试药

移液枪(德国Eppendorf公司)；TD20002电子天平(天津天马仪器厂)；精密电子天平PL203(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Sartorius PB-10pH计(德国赛多利斯公司)；LUX-24数显恒温水浴锅(北京陆希科技有限公司)；3K15型离心机(德国Sigma公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)。

三羟甲基氨基甲烷(AMRESCO，批号：2201C465)；凝血酶(SigmaT4648,批号：SLBV3604),牛纤维蛋白原(SolarbioF8050，批号：523C021)；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 群体特征考察与试验分组

使用电子天平对1193条宽体金线蛭依次称量体质量，根据其生殖环带颜色的深度和宽度判断是否完成受精，从而考察微山湖地区宽体金线蛭的群体分布特点，根据群体特征考察结果将宽体金线蛭分为10 g(8～12 g)、15 g(13～17 g)、20 g(18～22 g)3个试验组，每组不少于30只。

2.2 繁殖池

为了便于计数、防止不同试验组间宽体金线蛭逃窜，繁殖池使用60目的尼龙网制成上端开口的长方形网兜(见图1)，网兜中装入适量土壤，在网兜外部堆积适量土壤以达到保温保湿作用，产茧期间除适量浇水以保持适宜土壤湿度外，不作过多干扰，使其自然产茧。同时，为减少频繁检查对种蛭产茧的扰动，设置1个参照组以实时查看卵茧的成熟度，结合宽体金线蛭胚胎发育时相，选择适宜的挖茧时机。

图1 宽体金线蛭的繁殖池

2.3 繁殖性能考察指标

2.3.1产茧数 当参照组中60%的卵茧都处于发育中晚期时，挖出每个试验组繁殖池中的卵茧，独立计数，统计卵茧的总数目，以每个宽体金线蛭平均产得的卵茧数目作为该试验组的产茧数。

2.3.2茧体积 从每个试验组中随机挑选50%的卵茧，使用游标卡尺测量卵茧的长和宽，并计算平均值。

2.3.3出苗数 从每个试验组中随机挑选20个处于发育晚期的卵茧，在卵茧的较尖一端小心开口，用蒸馏水将宽体金线蛭的幼苗从卵茧中冲刷至培养皿中，独立计数，计算平均值。

2.4 产茧后水蛭药材质量质量评价

依照《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)对上述3个试验组产茧前后的水蛭药材分别进行性状观察和抗凝血酶活性测定。

精密称定宽体金线蛭待测样品粉末(过三号筛)1 g，精密加入0.9%氯化钠溶液5 mL，充分搅拌，浸提30 min，并时时振摇，5000 r·min-1(离心半径7.6 cm) 离心15 min，精密量取上清液100 μL于2 mL离心管中，加入含0.5%牛纤维蛋白原的Tris-HCl缓冲液(现用现配)200 μL，混合均匀，置于37 ℃水浴温浸5 min，滴加凝血酶(10 U·mL-1，每4 min滴加1次，每次2 μL，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，计算各样品对应的抗凝血酶活性。

3 结果

3.1 微山湖地区宽体金线蛭野生种群特征考察

共采集宽体金线蛭1193条，其体质量的平均值为(11.17±5.51)g，中位数为9.68 g，第一和第三四分位数分别为7.26和13.58，体质量总体偏小。体质量<6 g的宽体金线蛭有151条，占比12.66%；体质量≥10 g的宽体金线蛭有567条，占比47.53%；体质量≥15 g的宽体金线蛭有233条，占比19.53%。宽体金线蛭的生殖环带位于24～42环，完成受精后的生殖环带呈现金黄色(见图2A)，生殖环带的颜色、深度和宽度随宽体金线蛭体质量的增加而加深和变宽，体质量<6 g的宽体金线蛭多数生殖环带不明显，体质量≥10 g的宽体金线蛭均能观察到较明显的生殖环带，体质量≥15 g宽体金线蛭的生殖环带颜色显著加深和变宽，触之可迅速蜷缩成球，并呈现较强的弹性(见图2 B～C)。

注：A.具有生殖环带的宽体金线蛭；B.受到刺激蜷缩成球(腹部)；C.受到刺激蜷缩成球(背部)。图2 宽体金线蛭的形态特征

宽体金线蛭生殖环带的成熟度与体质量关系密切，本研究根据群体特征将其分成3个试验组：10 g组(8～12)g、15 g组(13～17) g、20 g组(18～22)g，在群体中的数目分别为395、148、114条。

3.2 体质量对宽体金线蛭繁殖性能的影响

生殖环带发育成熟的宽体金线蛭入土约1周后即可产茧，卵茧的发育周期约为3～4周，卵茧的成熟度使用自制的LED灯箱进行检测，大致分为早、中、晚3个时期(见图3A～C)，早期卵茧呈粉红色，茧液在LED灯下清亮透明，中期卵茧呈棕黄色，在LED灯下可观察团状胚胎阴影，后期卵茧变空，肉眼可观察到黑褐色宽体金线蛭幼体。3个时期分别对应发育时相的囊胚期、体节期和孵化期。囊胚期(见图3 D)在卵裂作用下细胞数快速增加，前期体积无明显变化，后期经原肠运动，卵黄细胞被完全包被在胚胎内部，形成卵黄合胞体层；在体节期(见图3 E)完成体节分化、神经管形成、前后吸盘和其他器官原基开始出现；孵化期(见图3 F)完成器官的最终发育，并孵化为可以自由游动的宽体金线蛭幼体[37-39]。

本研究在卵茧发育的晚期进行挖茧作业。3个试验组的产茧数差异明显，分别为3.7、4.5、5.9个，20 g组的产茧数是10 g组的1.59倍。茧体积虽然随宽体金线蛭体质量的增加而变大，但差异并不明显，茧的长度为19.11～21.10 mm，茧的宽度为14.19～16.30 mm(见图4)。从出苗数来看，各试验组内卵茧的个体间均存在一定的差异，在箱形图上均呈现较宽的分布区间，20 g组单个茧平均出苗37.3条，是10 g组的1.45倍(见图5)。

注：A.早期发育阶段的卵茧；B.中期发育阶段的卵茧；C.晚期发育阶段的卵茧；D.囊胚期；E.体节期；F.孵化期。图3 不同发育阶段的卵茧和不同发育时相的宽体金线蛭

图4 不同体质量组宽体金线蛭卵茧体积

图5 不同体质量组宽体金线蛭卵茧出苗数

3.3 宽体金线蛭产茧后药材的质量评价

3个试验组的宽体金线蛭在产茧后体质量损失率接近，处于54%～59%，18～22 g试验组的体质量平均值由20.59 g减少到8.71 g，各试验组的存活率存在较显著差异，20 g组的存活率是10 g组的1.44倍(见表1)。宽体金线蛭产茧后体质明显变差，吊干后药材的质量变轻，宽度变窄，厚度仅为产茧前药材厚度的48.98%～71.79%，但药材的长度变化并不明显(见表2)。背部颜色变化不明显，但腹部颜色由棕黄色变为黑棕色(见图6)。药材的腥味略有下降，断面颜色变深，较产茧前难折断，脆度下降。采用凝血酶滴定法测定各组药材的抗凝血酶活性后发现，各组每l g药材含抗凝血酶活性为3～5 U(见表3)，产茧前后抗凝血酶活性变化不大(结果详见表3)，均符合《中国药典》标准。

表1 不同体质量分组的宽体金线蛭产茧前后的变化

注：A.10 g组(产茧前)；B.15 g组(产茧前)；C.20 g组(产茧前)；D.10 g组(产茧后)；E.15 g组(产茧后)；F.20 g组(产茧后)。图6 产茧前后药材性状比较

表2 产茧对宽体金线蛭药材性状的影响

表3 产茧对宽体金线蛭抗凝血酶活性的影响

4 讨论

4.1 宽体金线蛭的种群特点与种蛭筛选原则

种蛭筛选是宽体金线蛭养殖的重要环节，本研究表明水蛭的产茧数、出苗数等主要繁殖性能指标随宽体金线蛭体质量的增加而显著提高，20 g组可获得的幼蛭数目为同等种蛭数目10 g组可获得的幼蛭数的231.43%，种蛭的死亡率也更低，相差约4.1倍。使用体质量大的水蛭进行繁殖将获得更多的幼蛭，损失的水蛭也较少，史红专等[28]推荐人工养殖时应选择体质量在20 g左右的宽体金线蛭作为种蛭。但是，体质量≥20 g的宽体金线蛭仅占野生种群的9.05%，若以整个种群进行计算，10、15、20 g组可分别获得3.8、2.1、2.5万条幼蛭。因此，仅使用≥20 g的宽体金线蛭进行繁殖并不现实、也不经济，可以使用≥20 g的宽体金线蛭构建良种选育群体[40]，建议以15 g及以上的宽体金线蛭进行繁殖生产。此外，本研究还发现微山湖地区野生宽体金线蛭的体质量普遍较小，有超过30%的宽体金线蛭体质量<8 g，这表明微山湖地区野生宽体金线蛭的种群有退化趋势，成年水蛭、特别是体质量较大的多年生宽体金线蛭数量较少，这与微山湖地区过度捕捞及生态环境恶化有关，有研究指出微山湖地区的重金属污染已达到重度污染水平[41]，有机氯农药污染水平也高于国内其他地区湖泊[42]，相关部门应在微山湖地区“退渔还湖”背景下加强对宽体金线蛭捕捞的科学指导，春秋“捕大放小”、夏季禁止捕捞。对微山湖地区宽体金线蛭进行群体考察，不仅能为制定合理的宽体金线蛭种蛭筛选原则提供科学依据，从而提高人工养殖的效率，同时也能反映微山湖地区宽体金线蛭的种群特点，为相关部门加强对宽体金线蛭捕捞的科学指导提供参考意见。

4.2 产茧对水蛭药材质量的影响

由于越冬技术不成熟，生产中常以野外捕捞的宽体金线蛭进行繁殖育苗，通常不进行分拣直接入土繁殖，产茧后多数宽体金线蛭触之不能很快成球，直接死亡率约30%，入水后死亡率可达70%以上，因此多数养殖户将产茧后的水蛭直接加工成药材进行销售。此时，药材的厚度明显变薄，仅为产茧前药材厚度的50%或更低，脆度降低，这可能与宽体金线蛭产茧过程中消耗能量过多导致体质变差，吊干时宽体金线蛭肌肉弹性降低有关。产茧前后药材的抗凝血酶活性变化不大，均为3～5 U·g-1，但低于欧兴长等[43]测定的宽体金线蛭药材抗凝血酶活性，与单宇等[3]以及丁月珠等[44]的研究接近。吴曼郡等[45]的研究表明宽体金线蛭的抗凝血酶活性与其吸食密切相关，吸食后第5天达到最高值14.67 U·g-1，第11天降低到6.50 U·g-1。宽体金线蛭的冬眠时间约为3～4个月，冬眠期间头部和尾部弯曲呈“弯月”状，不食不动，呼吸代谢和消化代谢非常微弱[46-47]，春季为宽体金线蛭抗凝血酶活性的低谷期。同时，《名医别录》[48]记载，水蛭“五月、六月采”，相当于公历的6、7月份，《中国药典》也规定水蛭的采收时间为夏、秋两季。此外，春季是宽体金线蛭的繁殖期，大肆捕捞野生宽体金线蛭会对其生存造成毁灭性破坏，不利于宽体金线蛭野生资源的可持续发展。因此，不建议春季进行野生水蛭药材采收，产茧后所获得的药材也不建议作为临床饮片使用。