高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定海藻中5种砷形态

陈露，嵇晶，金佳颖，郑丽杰，韩威，王欣之,3*，刘睿,3，吴皓,3*

1(南京中医药大学 药学院，江苏 南京， 210023) 2(江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏 南京， 210023)3(江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京， 210023)

海藻是我国出口创汇的重要海产品，深受国内外消费者的喜爱，含有丰富的碘、膳食纤维、蛋白质、多糖、多酚、甾醇等营养物质和活性物质[1-3]，具有潜在的经济开发价值[4-6]。海藻由于细胞壁的多孔结构及自身机制极易富集水中的砷，被称为海洋生态系统的“砷库”。砷在自然界存在着不同的形态，毒性由大到小依次为：亚砷酸根(As3+)>砷酸根(As5+)>一甲基砷(monomethylated arsenic,MMA)>二甲基砷(dimethylated arsenic,DMA)>砷甜菜碱(arsenobetaine,AsB)[7]，无机砷毒性(As3+和As5+)大于有机砷(MMA和DMA)，AsB则无毒[8]。因此分析海藻中砷的存在形式及有机砷、无机砷的比例，是评价海藻是否可食用或药用的重要参照依据。

目前砷形态的分析技术有很多[9-12]，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)具有检出限低、灵敏度高和线性范围宽的优势，已成为目前最常用且有效的方法之一，被广泛应用于不同基质[13-16]的砷形态分析。在分析前需对样品进行提取，常用提取方法为水[17]、不同比例的甲醇-水[18]、盐酸[19]、硝酸[20]、酶试剂[21]等提取液结合超声提取、微波消解、热浸提等方法，对不同的样品选择合适的提取方式,保证较高的提取率。不同的方法均有优缺点，如酶解法适合蛋白质含量较高的肉类；甲醇提取法若浓度过高会降低仪器的使用寿命；盐酸中的Cl与Ar形成40Ar35Cl 从而干扰75As的测定[22],因此选择合适的提取方法是实验成功的关键。

本研究采用HPLC-ICP-MS技术以铜藻中5种形态砷的提取量及总砷提取率为指标,对比GB 5009.11—2014[23]及GB/T 23372—2009[24]中规定的试样提取方法，对提取剂浓度、温度进行优化，并将优化得到的方法对不同海藻(海带、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻)进行分析，以期为海藻的食用安全、品质把控及标准制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

各海藻信息如表1所示。亚砷酸根(As3+)溶液标准物质(GBW08666)、二甲基砷(DMA)溶液标准物质(GBW08669)、一甲基砷(MMA)溶液标准物质(GBW08668)、砷酸根(As5+)溶液标准物质(GBW08667)、砷甜菜碱(AsB)溶液标准物质(GBW08670),中国计量科学研究院；甲醇(色谱级),美国天地；HNO3、NH4H2POm4(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司；其他提取用试剂均为国产优级纯。

MARS微波消解仪，美国CFM公司；NEXIOH 350D电感耦合等离子体质谱仪、Series 200高效液相，美国Perkin Elmer公司。

表1 藻样品的采集海域、日期及来源Table 1 Sea area,date and source of seaweed samples

1.2 仪器条件

色谱柱为Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)阴离子交换色谱柱。体积流量1 mL/min，柱温30 ℃，进样量50 μL；流动相A：25 mmol/L NH4H2PO4溶液(氨水调至pH=8)；流动相B：水；梯度洗脱：0～15 min，100%～0%水；16～19 min，0%～100%水；20～24 min，100%水。

ICP-MS条件：高频等离子体发射功率，1 550 W；载气为高纯氩气；同心雾化器；载气流速0.85 L/min；气补偿气流量0.15 L/min；采样深度9.5 mm；采集75As；蠕动泵转速0.3 r/min。

1.3 标准溶液的配制

分别精密称取AsB、As3+、DMA、MMA、As5+标准溶液适量，加水配制成1 000 ng/mL (以砷计)的标准储备液。精密吸取标准储备液适量，加水配制成一系列梯度浓度(均以砷计)的混合标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 总砷的测定方法

按照GB 5009.268—2016中[25]规定的“第一法 电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)”进行检测。

1.4.2 海藻样品砷形态分析

硝酸-热浸提：按GB 5009.11—2014[23]中规定的“试样提取”方法对铜藻进行处理后，进HPLC-ICP-MS检测。

水-超声提取：按GB/T 23372—2009[24]中规定的“植物性固体样品”提取方法对铜藻进行处理后，进HPLC-ICP-MS检测。

优化后提取方法：取适量海藻样品，加入20倍体积0.30 mol/L硝酸，在100 ℃恒温箱内浸提2.5 h，每隔0.5 h取出振荡1 min，冷却至室温，在8 000 r/min下离心15 min，取上清液过0.45 μm有机滤膜，进HPLC-ICP-MS测定。

1.5 数据分析处理

数据采用SPSS 22.0软件进行分析，数据先进行正态分布检验和方差极性检验，符合两者检验的数据进行单因素方差分析，两两比较用LSD检验；不符合则采用Kruskal-Wallis 多重比较。

2 结果与分析

2.1 铜藻中总砷的含量

通过ICP-MS对10个海藻样品中总砷含量进行测定，结果见表2，不同海藻对于砷的富集量有显著差异，各个海藻中总砷的含量均超出GB 2762—2017《食品中污染物限量》[26]中规定总砷最高允许限量(0.5 mg/kg)的40～200倍。不同海域同种海藻之间总砷含量存在显著性差异，如鼠尾藻(S)、裙带菜(Q)，可能与不同海域受污染程度不同有关；同个海域不同采收时间的海藻中的总砷含量也存在显著性差异，如海带(H)、裙带菜(Q1,Q3)，可能与海藻在海水中富集砷的时间长短有关。海藻易富集海水中的砷，砷具有多种不同的形态，若用总砷评价海藻的食用安全显得十分局限，所以有必要对海藻中砷形态进行分离，确定有机砷及无机砷的比例，从而为评价海藻的食用安全提供依据。

表2 不同海藻中总砷含量的测定 单位：mg/kg

2.2 提取方法的选择

本文对比分析GB 5009.11—2014中规定的硝酸-热浸提法和GB/T 23372—2009中规定的水-超声提取法对铜藻中5种形态砷的提取量的影响，结果如表3所示。

表3 不同提取方法对铜藻中5种形态砷提取量的影响

由表3可知，硝酸-热浸提对铜藻中5种形态砷的提取总量为56.61 mg/kg，其提取率达71.19%，而水-超声提取法对应的提取率仅为40.87%；硝酸-热浸提法能提取得到各种砷形态，而水-超声法不能提取得到As3+；硝酸-热浸提所提取的AsB、As3、As5+含量均明显高于水-超声提取法。综合考虑，选用硝酸-热浸提法作为海藻砷形态分析的提取方法。

2.3 提取条件优化

2.3.1 最佳提取温度的确定

在HNO3浓度为0.15 mol/L时，考察提取温度分别为70、80、90、100 ℃对铜藻中5种形态砷提取量的影响，结果表4所示。由表4可知，随着提取温度的升高铜藻中总砷的提取率呈上升的趋势，100 ℃时提取率达最大为74.71%； 铜藻中DMA、MMA含量较低，当提取温度为70、80 ℃ 时，不能提取得到MMA，DMA提取量随提取温度的升高其变化趋势不明显，As5+提取量受提取温度的影响不明显；AsB和As3+的提取量随提取温度增加呈上升的趋势，当提取温度达100 ℃时，与70 ℃相比AsB、As3+提取量分别上升了53.08%、66.26%。因此本实验确定最佳提取温度为100 ℃。

表4 不同提取温度对铜藻中5种形态砷提取量的影响

2.3.2 最佳硝酸浓度的确定

在提取温度为90 ℃，考察浓度分别为0、0.15、0.30、0.45 mol/L的硝酸溶液对铜藻中5种形态砷提取量的影响，结果如表5所示。

表5 不同硝酸浓度对铜藻中5种形态砷提取量的影响

由表5可知，随着提取液浓度的增加，铜藻中总砷的提取率呈先上升后降低的趋势；当HNO3浓度为0.30 mol/L时，总砷提取率最高为86.09%，且在该浓度下，AsB、As3+、MMA提取量均最高；DMA提取量整体变化趋势均不明显，As5+的提取量随浓度的升高而增加；在HNO3浓度为0.45 mol/L时,As3+的提取量降低，而As5+的提取量上升，可能是HNO3浓度过高使低价的As3+氧化为高价态的As5+；综上,选择HNO3溶液浓度为0.3 mol/L为最佳浓度。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察

将一系列不同质量浓度的5种形态砷的混合标准溶液，按上述色谱条件取50 μL进HPLC-ICP-MS分析，测定结果以各形态砷的质量浓度为横坐标X，以响应值为纵坐标Y，绘制标准曲线，回归方程见表6。

表6 五种形态砷的线性范围、回归方程、相关系数Table 6 Linear ranges,regression equations andcorrelation coefficients of the five arsenic species

2.4.2 精密度、重复性及加标回收率考察

取质量浓度为100 ng/mL各形态砷混合标准溶液连续在HPLC上进样6次，计算RSD值,AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分别为1.56%、2.22%、1.58%、1.60%、5.79%。取适量铜藻粉末，按硝酸-热浸提的提取条件进行处理，共6份，进HPLC分析，计算RSD值，AsB、As3+、DMA、MMA、As5+的RSD分别为3.74%、8.42%、12.64%、8.86%、2.66%。取铜藻样品6份，分别加入砷标准混合溶液适量，按优化后的提取条件进行处理，计算加标回收率，5种形态砷的平均回收率为79.50%～115.73%，RSD均低于15%。

2.5 海藻中5种形态砷含量测定

按优化后的方法对不同海藻中5种形态砷含量进行测定，结果如表7所示。5种海藻中DMA、MMA含量均较低，毒性较大的无机砷在5种海藻中占比各有不同。T1铜藻中以As5+含量最高，无毒性的AsB次之，DMA含量最低，其中无机砷占总砷含量的58.39%，仅次于Y1羊栖菜。海带(H)、裙带菜(Q)中无机砷占比较低，约占总砷含量的15%，主要以无毒性的AsB形式存在，这与常家琪[27]、高继庆[28]的研究一致；Q2裙带菜中无机砷的占比低于T1铜藻及Y1羊栖菜(P<0.05)；Y1羊栖菜中AsB的占比低于Q2裙带菜及H1海带(P<0.05)；羊栖菜(Y)砷主要以毒性较大的无机砷形式存在，占提取总砷的50%～60%，与文献研究[29-30]一致；鼠尾藻中无机砷约占提取总砷的40%。按我国现行农业行业标准NY/T 1709—2011《绿色食品 藻类及其制品》[31]中规定藻类中无机砷限量应≤1.5 mg/kg，则所测的海藻样品中无机砷含量均超标，其中铜藻、羊栖菜、鼠尾藻严重超标，海带、裙带菜超标量较少。

表7 不同海藻中5种形态砷的含量测定

100 ng/mL的5种形态砷混合标准溶液(A)，铜藻(T1)、海带(H2)、鼠尾藻(S1)、羊栖菜(Y1)、裙带菜(Q3)的色谱图见图1。从图1可知，各形态砷峰形尖锐且能完全分离，灵敏度较高，说明该方法满足海藻砷形态分析的要求。

1-AsB；2-As3+；3-DMA；4-MMA；5-As5+图1 100 ng/mL混合标准溶液(A)及编号为T1、H2、S1、Y1、Q3海藻中5种砷形态色谱图Fig.1 Chromatograms of the five arsenic species in 100 ng/mL mixed standard solution (A) and T1,H2,S1,Y1,Q3 seaweed

3 结论与讨论

本研究建立了海藻中AsB、As3+、DMA、MMA和As5+等5种砷形态分析测定的HPLC-ICP-MS方法，并进行优化，确定以0.3 mol/L硝酸溶液为提取剂，样品在提取温度为100 ℃条件下提取为最优条件，该提取方法操作简便、快捷，总砷提取率较高；用所建立的分析方法对铜藻、海带、裙带菜、鼠尾藻、羊栖菜进行分析。结果表明，铜藻中以As5+含量最高，无毒性的AsB含量次之，DMA含量最低，其中毒性大的无机砷占提取总砷含量的58.39%；海带、裙带菜中砷化合物主要以无毒性的AsB形式存在；羊栖菜、鼠尾藻中无机砷占比分别约为50%～70%、40%；各海藻中毒性大的无机砷均超过NY/T 1709—2011《绿色食品 藻类及其制品》中规定的最高允许限量，其中铜藻、羊栖菜、鼠尾藻超标严重。

海藻中无机砷超标严重，其食用安全性引起消费者的关注。但目前对摄入海藻后不同形态砷化合物在体内代谢途径的探讨不够深入，且对海藻无机砷的风险评估还不完善，后续应对砷化合物的毒理学评价及风险分析进行深入研究，同时加强对海藻中无机砷含量的监测，为科学指导海藻的食用安全提供依据。