软水蓼不同目数超微粉体溶出物的化学成分分析

刘英波,鲁 丹,潘年松,*,冯 华,周德权

(1.遵义医药高等专科学校,贵州遵义 563005;2.遵义市食品药品检验所,贵州遵义 563002;3.遵义绿普森农业有限公司,贵州遵义 563000)

软水蓼(PolygonumhydropiperL.var.flaccidu(Meisn.)Steward.)为蓼科( Polygonaceae)蓼属(PolygonumL.)植物具行滞化湿、散瘀止血、袪风止痒、解毒功能,临床主要用于痢疾、泄泻、便血、痛经、湿疹、风疹等[1]疾病;现代药理研究表明具抗菌[2]及抗炎[3]等作用。同时软水蓼(PolygonumhydropiperL.var.flaccidu(Meisn.)Steward.)和水蓼(polygonumhydropiperL.)均被收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》,两者的地上部分作为辣蓼药材或饮片使用[1];软水蓼同属植物水蓼对甜酒曲中霉菌和酵母的生长具促进作用[4-5]和提高酒药糖化力、发酵力[6]。目前关于蓼科蓼属植物化学成分的报道主要为黄酮类、蒽醌类、苯丙素类和萜类等类型的化合物,约140个化合物,药理研究表明主要具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛、抗菌、杀虫等[7-8]作用,但仍然缺乏对软水蓼活性成分的药理作用及对制曲作用成分和机制进行深度挖掘。

超微粉碎技术是以植物药材细胞破壁为粉碎目的,使细胞破壁率达到95%以上,细胞内的有效成分直接暴露出来,增加活性成分的提取率和速度,提高生物利用度而增强疗效。超微粉碎技术在中药领域的研究与应用主要为药材、复方制剂、开发新型中药饮片、提取物加工等[9-10]方面,如对药材不同粒径的粉体进行粉体学性质、有效成分溶出度、化学成分、量效学、药代动力学、药理及药效学的影响及相关评价研究。中药材或饮片经超微粉碎后,细胞内的有效成分不需要通过细胞壁的屏障而直接溶解于溶剂中形成溶液,同时增大了比表面积,使粉体具有更好的溶解性、分散性、化学反应活性和生物利用度等特性,但也存在超微粉体的安全性、稳定性、粒径控制和临床研究相对较少等问题,对其推广应用受到一定限制。本研究将软水蓼地上部分不同目数超微粉体溶出物进行化学成分及峰面积值差异性研究,为明确软水蓼药效物质基础及其机制的阐明奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验所用药材 均由遵义绿普森农业有限公司湄潭县中药材基地提供,经遵义市食品药品检验所邓顺超副主任中药师鉴定为软水蓼(PolygonumhydropiperL.var.flaccidu(Meisn.)Steward.)的地上部分，标本保存于遵义医药高等专科学校中药标本馆;甲醇、乙腈和甲酸(质谱纯) 德国Merck公司 溶解不同目数粉体化学成分或色谱溶剂系统;水 广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1290 UPLC、8500FE-SEM场发射扫描电镜 安捷伦科技有限公司;色谱柱Waters Acquity UPLC®HSS T3,2.1 mm×100 mm,1.8 μm 沃特世科技(上海)有限公司;Triple TOF4600 LC/MS质谱仪 Sciex公司;TCL离心机 广州航信科学仪器有限公司;AB204-S型梅特勒电子天平 珠海天创仪器有限公司;HHS-6粉碎机 金坛市普瑞斯机械有限公司;KQ-300DE超声仪 天津市泰斯特仪器有限公司;BT-2001型激光粒度仪 丹东百特仪器有限公司;SYFM-8Ⅱ振动式药物超微粉碎机 济南倍力粉技术工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同目数粉体制备及粒径测定 将软水蓼采用普通粉碎机粉碎成粗粉，过筛后再采用超微粉碎机在-12～16 ℃,振幅6 mm条件下粉碎,50、120、200目粉体粉碎15 min;300和500目粉体粉碎45 min后得到不同目数粉体,经激光粒度仪采用干法测定粉体的体积、面积、比面积平均粒径大小,测定条件为样品折射率1.596+0.100i,光学模式Mie,介质折射率1.000,分析模式63.1。

1.2.2 不同目数粉体的形态特征 将软水蓼制备好的50、120、200、300和500目粉体适量,分别铺于扫描电子显微镜(SEM)样品台上,喷金镀膜后置SEM下放大进行形态特征观察。

1.2.3 软水蓼不同超微粉体化学成分检测

1.2.3.1 供试溶液制备 取软水蓼供试品相应目数粉末约0.5 g于50 mL离心管中,加入50 mL的80%甲醇溶液,超声提取30 min取出,放冷,12000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm滤膜即得待测样品。

1.2.3.2 色谱条件 色谱柱柱温25 ℃;进样量1 μL;检测波长254 nm;流动相比例和流速:A相0.1%甲酸水溶液,B相乙腈,流速0.3 L/min。见表1。

表1 流动相梯度Table 1 Mobile phase gradient

1.2.3.3 质谱条件 检测模式为负离子模式,具体质谱参数,见表2和表3。

表2 质谱MS参数Table 2 MS parameter list

表3 质谱MS/MS参数Table 3 MS/MS parameters of mass spectrometry

1.3 数据处理

采用Waters PeakView® software version:1.2.0.3(64-bit)软件智能控制系统,采集UPLC-Q-TOF-MSE数据;借助UNIFI科学信息系统,文献数据、TCM Chiese[UNIFI1.7]、ChemSpide在线数据库和Progenesis QI LC/MS数据分析软件,对化学组分进行识别鉴定和分析。化合物成分鉴定相似度得分:

系统质谱数据库已知成分的分子式、结构、质谱裂解碎片信息与待鉴定成分的分子式、结构与二级质谱裂解碎片信息的比较,相似程度越高,评价得分越高。

2 结果与分析

2.1 不同目数粉体粒径测定及其分布

软水蓼不同目数粉体的体积平均粒径随粉体所过的目数增加而降低;面积平均粒径300目时最低;而比表面积值则随样品所过目数增加呈上升趋势;不同目数的长度平均径值在300目时最短;过200目粉体的粒径遮光率最小;拟合残差值在120目时较低,至500目粉体时达最低值(见表4)。粒径大小的分布在50目时呈现连续两部分分布状态,一部累积值为32%,而另一部分则达到80%,从D10的粒径5.429 μm至D90粒径215.5 μm,说明粒径大小差异大,分布不均匀;120目时粉体粒径的累积值为约32%,从D10的粒径3.761 μm至D90粒径80.78 μm,粒径分布范围较50目的粉体小;200目的粉体累积值为约82%,300目和500目的粉体累积值均为95%,三者粒径大小分布基本相同,见图1。

表4 软水蓼药材不同目数粉体粒径大小Table 4 The particle size of different number powder of Polygonum hydropiper L.

图1 软水蓼不同目数粉体粒径分布图Fig.1 Particle size distribution of Polygonum hydropiper L. powder with different contents注:A:50目;B:120目;C:200目;D:300目;E:500目。

2.2 不同目数粉体的形态特征

软水蓼50目和120目粉体颗粒大小形状不规则,表面粗糙,可以看到原药材的粉末特征;软水蓼药材经粉碎后过200目以上的超微粉体大小逐渐有均匀的趋势,颗粒表面越来越光滑,原药材特征越来越不明显,见图2。

图2 软水蓼不同目数粉体的扫描电镜图Fig.2 Scanning electron microscopy of Polygonum hydropiper L. powder with different mesh numbers注:A:50目(1527×1);B:120目(1534×1);C:200目(1531×1);D:300目(1514×1);E:500目(1531×1)。

2.3 不同目数粉体溶出化学成分的质谱数据及鉴定

共鉴定出17个化合物,其中蔗糖、没食子酸、杨梅苷、槲皮苷4个化合物由数据库比对鉴定;金丝桃苷、异槲皮苷、没食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷、2″-O-没食子酰基槲皮苷、3,3′-Di-O-甲基鞣花酸、氢化胡椒甙、Vanicoside B、Vanicoside A、Vanicoside E、Vanicoside C、槲皮素11个化合物由参考文献鉴定;2个化合物2″-O-没食子酰基杨梅苷、2″-O-没食子酰基金丝桃苷通过推断鉴定。化合物杨梅苷、金丝桃苷、异槲皮苷为同分异构体,化合物杨梅苷中为鼠李糖基取代,而化合物金丝桃苷和异槲皮苷中为葡萄糖基取代,因此在质谱二级碎片,化合物杨梅苷有典型的碎片离子m/z 317(-146 Da),而化合物金丝桃苷和异槲皮苷中有碎片离子m/z 301(-162 Da),进一步结合数据库以及文献[11]中3个成分出峰先后顺序,确定3个成分。化合物2″-O-没食子酰基金丝桃苷、2″-O-没食子酰基杨梅苷和没食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷为同分异构体,与化合物杨梅苷、金丝桃苷和异槲皮苷这组异构体相比,准分子离子峰质量增加152 Da,且有相同的碎片离子,因此推测可能是在化合物金丝桃苷、异槲皮苷和杨梅苷的基础上引入1分子没食子酰基,进一步研究碎片信息,化合物2″-O-没食子酰基金丝桃苷、没食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷中有碎片离子m/z 301,因此推断化合物2″-O-没食子酰基金丝桃苷、没食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷是在化合物金丝桃苷或异槲皮苷的结构式引入的没食子酰基,根据参考文献[12]化合物没食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷在水蓼中有报道,化合物2″-O-没食子酰基金丝桃苷和2″-O-没食子酰基杨梅苷没有报道由推断得到;由于没有采集对照品数据且无参考文献报道化合物2″-O-没食子酰基金丝桃苷、没食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷和2″-O-没食子酰基杨梅苷在色谱中出峰先后顺序,因此化合物2″-O-没食子酰基金丝桃苷、没食子酰基槲皮素3-O-葡萄糖苷和2″-O-没食子酰基杨梅苷为暂时鉴定，以上结果见图3～图4和表5。

表5 软水蓼不同目数粉体溶出化学成分经UPLC-Q-TOF-MS分析的质谱数据及鉴定Table 5 Isolation and identification of Polygonum hydropiper L. compounds

图3 软水蓼DAD谱图(UV 254 nm)Fig.3 DAD spectra of Polygonum hydropiper L.(UV 254 nm)

图4 软水蓼质谱负离子模式鉴定色谱峰图Fig.4 Diagram of chromatographic peak number for negative ion pattern identification of Polygonum hydropiper L. mass spectrometry

2.4 黄酮类化合物峰面积值趋势

软水蓼不同目数超微粉体溶出的黄酮类化合物总体的峰面积值(表6),从过50目筛的粉体逐渐升高,在120目出现较高的峰面积值,随后从200～300目逐渐降低,再到500目时呈逐渐升高趋势,其原因可能与不同的黄酮类化合物成分的分子结构和基团性质、在植物细胞内的存在形式等有关。其中2″-O-没食子酰基杨梅苷的峰面积值从50目上升至120目时最高,随后降低,相对峰面积值为1.14%;杨梅苷的峰面积值从50～200目逐渐上升,然后在300 目时有所降低,在500 目时再次升至最高,相对峰面积值为18.26%;金丝桃苷的峰面积值从50目逐渐上升至200目时最高，然后在200～300目之间有所降低，500目时逐渐上升，相对峰面积值为13.24%；异槲皮苷和槲皮素-3-O-(6′-O-没食子酰)-beta-D-吡喃半乳糖苷的峰面积值从50目逐渐上升至120目时呈现最高的峰面积值,然后在200目时有所降低之后,再逐渐升高,相对峰面积值分别为3.85%和0.89%;槲皮苷和2″-O-没食子酰基金丝桃苷的峰面积值从50目逐渐上升至120目呈现较大峰值,然后在300目时峰面积值较低,在500目时峰面积值再次上升至最高,相对峰面积值分别47.11%和2.7%;3″-O-没食子酰基槲皮苷的峰面积值在过120目筛时最高,在300目时降至最低,再逐渐升高,相对峰面积值为9.0%;槲皮素的峰面积值从50目至500目呈逐渐上升趋势,相对峰面积值为3.81%。见表6。

2.5 苯丙素类化合物峰面积值趋势

软水蓼不同目数粉体溶解出的苯丙素类化合物峰面积值从50目下降至300目最低值,随后呈上升趋势(表6)。其中氢化胡椒苷的峰面积值50目时最高,在120目时下降至最低,随后逐渐上升,相对峰面积值为10.5%;Vanicoside C在200目和300目中没有检测出峰面积,相对峰面积值为2.1%;Vanicoside B和Vanicoside A的峰面积值在50目时最高,在300目时降至最低,然后逐渐升高,相对峰面积值分别为47.79%和18.66%;Vanicoside E的峰面积值在50目时最高，在200目时降至最低,随后逐渐升高,相对峰面积值为20.95%。

表6 软水蓼不同目数粉体中黄酮类和苯丙素类化合物峰面积汇总表Table 6 Summary of peak area of flavonoids and phenylpropanoids in different orders of Polygonum hydropiper L. powder

3 讨论与结论

采用超微粉碎技术将软水蓼原生药材或饮片粒径从150～200目提高到300目以上,该细度条件下的细胞破壁率大于95%,体积平均粒径中除50目粉体外大于90.22 μm外,其他的面积平均粒径、比表面积均在1～75 μm范围内;同时达到破壁饮片中间体粒径要求是 D90<45 μm的要求,可成为当前新型饮片之一,并具有均匀性高、药材利用率高、服用方式多样、全成分保留、单方与灵活组方兼顾等优势,保持了中医药辨证施治、临证加减的用药特性,破壁饮片及其技术既是传统中药粉末应用的创新与发展,又遵循中医药理论自身规律和特色[24-25]。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技术分别对软水蓼药材经粉碎过50、120、200、300和500目筛的粉体进行化学成分定性分析,鉴定出黄酮类、苯丙素类、有机酸、多糖及鞣质17个化合物首次从该植物中分离检测到;其中苯丙素类化合物Vanicoside C在200、300目粉体中没有检出,可能与粉末在溶出过程中存在溶出与吸附平衡,微粉溶出虽然稍多,但药材超微粉碎粒度过小易于团聚,成分溶解后不易分散、溶出度反而降低,药物粉体对极性成分的吸附力增大,从而使其不易溶出有关[9,26]。软水蓼不同目数超微粉体中溶出的黄酮类化合物峰面积值较高,而苯丙素类化合物的峰面积值较低,其原因可能与两大类型化合物的理化性质差异及在溶剂中的溶解度等有关;如再进一步增加粉碎度,可能药用成分的含量会有所提高,但其成本会相应增加,如设备投入增加,而且细胞壁里的很多杂质、无效成分、甚至毒性成分等也会破碎而出,增加不确定的影响因素和增加对药用成分的吸附性,反而降低药用成分的含量。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技术对软水蓼药材超微粉体进行化学成分定性分析，能够直观准确地反映软水蓼不同目数粉体化学成分的变化情况，从整体上弥补了HPLC和UPLC分析的不足,为软水蓼药效物质基础的阐明和系统评价(安全性评价、有效性评价、生物利用度、药理、药效及药代等)、稳定性和质量标准等[28]深入研究奠定基础。