响应面法优化富硒粗毛纤孔菌菌丝生长培养基成分

(福建生物工程职业技术学院,福建福州 350007)

粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)属于锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)纤孔菌属(Inonotus),又名粗毛黄褐孔,是一种珍惜的药用真菌[1]。该菌以寄生为主,主要分布于新疆、宁夏、内蒙古、黑龙江、吉林等北温带地区[2-3]。该菌在民间作为“桑黄”采集入药,常用于糖尿病、痛风、关节炎等疾病[2]。经国内专家学者对该菌进行考证,发现该菌即为古代中药“桑黄”[4-5]。此外,大量研究表明该菌具有多种生物活性,如抗病毒[6]、抗氧化[7-9]、抗肿瘤[10-13]、降血脂[14]、活血化瘀[15-16]、保肝[17]及提高免疫力[18]等作用。目前对该菌的研究主要集中在鉴定[9,19]、菌种筛选[20]、栽培[21-22]以及多糖[7]、酚类化合物[9]、三萜[14]等生物活性代谢物及小分子化合物[11]的提取及研究方面。

已有研究表明,食药用菌如平菇、双孢菇、雨伞菇、草菇、榆黄菇、牛肝菌、灵芝等具有转化无机硒并积累有机硒元素的有效机制[39-44]。理论上野生食药用菌中硒含量应具较高水平,但实际上大多数野生食药用物种都处于硒缺乏状态,每克子实体干重含硒浓度小于1 μg[45]。研究表明,食药用菌积累微量营养素的能力受土壤基质、真菌种类和元素类型的影响[46],且生长基质中硒的浓度也会阻碍食药用菌菌丝的生长和子实体的形成[47-48]。因此,了解食药用菌对无机硒的耐受度及合理的富硒培养基成分是生产富硒功能性食药用菌的前提条件。现如今,关于粗毛纤孔菌对无机硒的耐受度及富硒培养基成分还鲜有报道。本研究通过响应面法对富硒粗毛纤孔菌菌丝生长培养基成分进行优化,旨在减少无机硒对粗毛纤孔菌的抑制作用,最大程度保证该菌菌丝能够在富硒的同时,正常甚至更好地生长,提高富硒菌丝的产量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗毛纤孔菌(Inonotushispidus) 福建农林大学国家菌草工程技术研究中心提供;亚硒酸钠 西亚试剂公司;葡萄糖 西陇科学股份有限公司;硫酸镁 阿拉丁工业有限公司;磷酸二氢钾 西陇科学股份有限公司;VB1山东西亚化学工业有限公司;浓硝酸 南京化学试剂股份有限公司;母种培养基 为改良PDA培养基:马铃薯200 g/L、葡萄糖30 g/L、硫酸镁0.75 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、维生素B1(VB1)1 mg/L、琼脂15 g/L。

LDZX-50FBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2A超净工作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司;HPX-9272MBE电热恒温培养箱 上海博迅实业有限公司;X-seriesⅡ电感耦合等离子体质谱仪 Thermo股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 母种活化及接种 取粗毛纤孔菌斜面母种约0.25 cm2接种于改良PDA平板中,倒置于恒温培养箱30 ℃暗光培养。待菌丝生长覆盖至平板2/3左右,于菌落边缘取直径为0.6 cm活化菌块作为后续实验母种。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 硒浓度对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 以改良PDA培养基为基础,向其中添加1 mg/mL亚硒酸钠溶液,通过梯度稀释法配制硒浓度分别为2.33、4.66、9.31、18.63、37.25、74.5、149、298和596 mg/L的供试培养基,以无硒添加的改良PDA培养基为对照(CK)。将供试培养基注入灭菌(121 ℃、20 min)后的培养皿,每皿约25 mL,冷却凝固后接入直径为0.6 cm的活化菌块,每个浓度5个重复。30 ℃暗光倒置培养8 d后,观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,使用游标卡尺利用十字交叉法精确测量菌落生长直径,记录数据。

1.2.2.2 常规培养料对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 以改良PDA培养基为基础,分别配制麸皮、玉米粉、大米、豆粉培养基,用以筛选粗毛纤孔菌菌丝最适生长培养料。其中:

麸皮培养基:麸皮50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。

玉米粉培养基:玉米粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。

大米培养基:大米50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。

豆粉培养基:豆粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。

每种培养基5个重复,30 ℃暗光倒置培养8 d后观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,测量并记录数据。

1.2.2.3 补充碳源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 以改良PDA培养基为基础,将培养基中的葡萄糖(30 g/L)调整为等量蔗糖、乳糖、果糖或海藻糖,每种培养基5个重复,30 ℃暗光倒置培养8 d后观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,测量并记录数据。

1.2.2.4 培养基pH对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 多数食药用菌适宜在微酸和中性pH条件下生长,因此,以改良PDA培养基为基础,将培养基pH分别调整为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,每种培养基5个重复,30 ℃暗光倒置培养8 d后观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,测量并记录数据。

1.2.3 Box-Behnken design优化粗毛纤孔菌菌丝 富硒培养基配方为考察培养基各成分与外源硒对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响及其之间的交互效应,以单因素实验结果为依据,以粗毛纤孔菌菌丝生长速度为指标(Y),在最适pH条件下,采用Box-Behnken模型设计三因素、三水平组合实验(表1),对结果进行响应面分析,得到最优响应Y值,从而得到最佳富硒粗毛纤孔菌菌丝培养基配方。

表1 BBD实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of BBD experiment

1.2.4 菌丝生长情况检测 菌丝生长情况通过菌丝平均生长速度进行评估,利用十字交叉法对培养后平板内粗毛纤孔菌菌丝进行测量,测量所得菌丝生长直径除以培养时间即为菌丝生长速度,其中菌丝生长直径为测量获得总直径减去初始直径。最大耐受浓度(MTC)指不引起受试对象出现死亡的最高计量,即当实验浓度处于最大耐受浓度时,菌丝体有生长;而实验浓度高于MTC时,则生长被完全抑制。

1.2.5 富硒粗毛纤孔菌菌丝硒含量的测定 参考食品安全国家标准(GB 5009.268-2016)[49],采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS),精确称取富硒粗毛纤孔菌菌丝干试样0.5 g于聚四氟乙烯消解内罐,加5 mL硝酸浸泡过夜。封好消解罐放入恒温干燥箱,160 ℃保持6 h,自然冷却至室温后打开加热赶酸至近干,将消化液吸入25 mL容量瓶中,用少量1%硝酸溶液洗涤内罐和内盖3次,合并洗液,用1%硝酸定容,混匀备用。将试样溶液与空白溶液分别注入电感耦合等离子体质谱仪中,测定硒元素含量。

1.3 数据处理

利用DPS 7.05软件对实验数据进行随机单因素方差分析,采用Tukey多重比较法进行显著性检验。利用Design-Expert 8. 06软件对响应面实验进行设计、分析并绘制响应曲面。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 硒浓度对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 由图1可知,粗毛纤孔菌菌丝的生长情况受外源硒影响较大。当培养基中所添加硒浓度≤18.63 mg/L时,粗毛纤孔菌菌丝的生长速度与对照组无显著性差异(P>0.05)。随处理浓度的升高,当硒浓度≥37.25 mg/L时,粗毛纤孔菌菌丝生长开始受到明显的抑制,其生长速度显著性降低(P<0.05)。当硒浓度达到298 mg/L时,粗毛纤孔菌菌丝略有生长,其生长速度与零生长组(即完全抑制组,硒浓度为596 mg/L)无显著性差异(P>0.05)。因此,粗毛纤孔菌菌丝对硒的最大耐受浓度为298～596 mg/L,而后续实验中硒的浓度以18.63 mg/L为宜。

图1 硒浓度对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响Fig.1 Effect of Se concentration on themycelia growth rate of I.hispidus注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图2～图4同。

2.1.2 常规培养料对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 由图2可知,粗毛纤孔菌菌丝在常规培养料配制的培养基上均能生长,但其菌丝生长速度存在显著性差异(P<0.05),且菌丝稠密度相差较大。粗毛纤孔菌在麸皮培养基上生长效果最好,其菌丝的生长速度可达到6.6 mm/d,且菌丝稠密度最高;其次为改良PDA培养基;以玉米粉、大米、豆粉为培养料时,其菌丝生长速度显著降低(P<0.05),且菌丝稠密度明显弱于改良PDA培养基。此外,粗毛纤孔菌菌丝对玉米粉的可利用度最低。因此,后续实验选取麸皮为培养基。

图2 常规培养料对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响Fig.2 Effect of the principal components of culture mediumon the mycelia growth rate of I.hispidus注:菌丝的稠密度:+++:CK程度,++++:高于CK程度,++:低于CK程度,+:低于++程度;图3、图6同。

2.1.3 补充碳源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 如图3所示,粗毛纤孔菌对不同补充碳源的可利用度不同,以不同类型的补充碳源作为培养基成分,其菌丝生长速度存在显著性差异(P<0.05),且菌丝稠密度相差较大。当以葡萄糖作为补充碳源时,粗毛纤孔菌菌丝生长速度最高,菌丝稠密度最佳;以蔗糖、果糖、海藻糖作为补充碳源时,其菌丝生长速度稍低,菌丝稠密度则明显弱于葡萄糖的效果。粗毛纤孔菌菌丝对乳糖的可利用度最低。因此,后续实验选取葡萄糖作为补充碳源。

图3 补充碳源对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响Fig.3 Effect of supplementary carbon sourceon the mycelia growth rate of I. hispidus

2.1.4 pH对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响 由图4可知,当pH条件偏酸时,该粗毛纤孔菌菌丝生长速度偏低;当pH处于6.5～7.5时,该粗毛纤孔菌菌丝生长速度先随pH的增大而增加,再随pH的增大而降低,于pH7.0时达到最佳,表明该粗毛纤孔菌菌株在中性pH条件下长势最好。因此,后续实验中pH条件以7.0为宜。

图4 pH对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响Fig.4 Effect of pH on the mycelia growth rate of I.hispidus

2.2 响应面法优化粗毛纤孔菌菌丝富硒培养基配方

2.2.1 响应面试验结果及方差分析 通过Design-Expert 8.06软件设计响应面试验,基于单因素结果,以麸皮(X1)、葡萄糖(X2)及硒(X3)为自变量,以粗毛纤孔菌菌丝生长速率平均值为响应值(Y),进行响应面试验,试验方案与结果见表2。通过Design-Expert 8.06对表2结果进行分析,得到的3因素与菌丝生长速度(Y)之间的回归模型可以表述为:

表2 BBD实验设计及结果Table 2 Design matrix and the results of Box-Behnken

2.2.2 各因素交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的响应面分析 为考虑交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响,在另一因素条件固定不变(编码水平为零)的情况下,分析两两因素交互作用对其菌丝生长速度的影响。通过Design-Expert 8.06软件处理上述实验设计得到3D响应曲面图和等高线分析图(图5),可以直观地看出各个因子之间的交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响。响应面分析中,等高线的形状可以反映两因素间交互作应对响应值影响的强弱大小,圆形表示不显著,椭圆形则与之相反;等高线的稀疏情况反映响应面图像的平陡情况。从图5可以看出,两两因素之间的等高线形状均为椭圆形,表明其交互作用显著。由图5A可知,粗毛纤孔菌菌丝生长速度(Y)随麸皮添加量(X1)和葡萄糖添加量(X2)的增加而增加;由图5B可见,粗毛纤孔菌菌丝生长速度(Y)随麸皮添加量(X1)的增加和硒添加量(X3)的减小而增加;在较小硒添加(X3)情况下,麸皮添加量(X1)

表3 菌丝生长速度响应模型的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of mycelia growth rate

图5 两两因素交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度影响的响应曲面图和等高线分析图Fig.5 The interactive effects between(A)bran and glucose,(B)bran and Se,(C)glucose and Seon I. hispidus mycelia growth rate showed by 3-D response surface and 2-D contour plots

在很大的范围内均可取到较大的Y值;图5C也表现出与图5B相同的趋势,表明硒添加对粗毛纤孔菌菌丝生长不利,但可以通过其他因素与其交互作用减少其对粗毛纤孔菌菌丝生长抑制作用的影响。综合各图,各因素之间的交互作用与回归模型的方差分析结果相吻合。由Design-Expert 8.06软件分析得到最大响应值(Y)时最优培养基配方为:麸皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,此时富硒粗毛纤孔菌菌丝生长速度预测值为8.19 mm/d。

2.3 验证实验

为了检测响应面结果的准确性,以改良PDA培养基为阴性对照,以等量硒添加改良PDA培养基为阳性对照,配制上述最优培养基配方进行富硒粗毛纤孔菌菌丝培养实验,每组八个重复,测得粗毛纤孔菌及富硒粗毛纤孔菌菌丝生长速度见图6。响应面优化培养基实测值8.41 mm/d>预测值8.19 mm/d>改良PDA实测值6.79 mm/d>等量硒添加改良PDA实测值 4.28 mm/d,且优化后的富硒培养基培养的粗毛纤孔菌菌丝的稠密度更高(图6)。与等量硒添加改良PDA相比,以响应面优化培养基进行培养,粗毛纤孔菌菌丝生长速度提高了0.965倍。此外,通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对最优培养基培养菌丝的硒富集量进行检测,测得富硒粗毛纤孔菌菌丝硒富集量为31.584 μg/g。说明采用响应面法获得的模型能较好地预测富硒粗毛纤孔菌菌丝的生长情况,该富硒培养基配方可以减少外源硒对粗毛纤孔菌菌丝抑制作用的影响,使其能够在富硒的同时正常甚至更好地生长,提高富硒菌丝的产量,具有一定的实用价值。

图6 验证实验结果Fig.6 The results of verification test

3 结论

首次针对粗毛纤孔菌对无机硒的耐受度进行探索,发现该菌菌丝的生长情况受外源硒影响较大,当硒浓度达到或大于37.25 mg/L时,该菌菌丝生长受到显著的抑制作用(P<0.05)。因此,本研究通过响应面法对该菌富硒培养基成分进行优化,旨在保证该菌菌丝在正常生长情况下合理富集、积累并转化无机硒为有机硒,提高富硒粗毛纤孔菌菌丝的产量。

经响应面法优化得到富硒粗毛纤孔菌菌丝生长最优培养基配方为:麸皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L。其中葡萄糖添加量、麸皮添加量和硒添加量对富硒粗毛纤孔菌菌丝生长均具有极显著作用;且麸皮与葡萄糖、麸皮与硒添加、葡萄糖与硒添加之间的两两交互作用对富硒粗毛纤孔菌菌丝生长均具有显著作用(P<0.01)。在此条件下,富硒粗毛纤孔菌实际菌丝生长速度达到8.41 mm/d,与预测值相符,且硒富集量达到31.584 μg/g。说明采用响应面法优化获得的富硒粗毛纤孔菌菌丝生长培养基配方具有一定的实用价值。

该配方通过培养基内因素间的交互作用减少了外源硒对粗毛纤孔菌菌丝生长抑制作用的影响,确定了合理的硒添加比例,与等量硒添加改良PDA相比,优化后粗毛纤孔菌菌丝生长速度提高了约1倍(0.965倍);与同配方无硒添加培养基相比,菌丝硒含量增加为31.584 μg/g。国际营养联合会规定缺硒人群每人每天食用硒量不少于50 μg,每人每天食用本研究富硒粗毛纤孔菌制品1.58 g即可完全满足此要求。本研究在硒抑制与菌丝生长之间找到平衡点,获得了最优配方,为富硒粗毛纤孔菌菌丝体的大量制备、富硒粗毛纤孔菌子实体的栽培及其它后续研究提供了理论依据。