肠道菌群与结核病之间相关性的研究进展

陈竹，陈军华

重庆医科大学附属儿童医院感染科； 儿童发育疾病研究教育部重点实验室； 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心； 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地； 儿科学重庆市重点实验室， 重庆 400014

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染引起的一种传染病。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)报道，在2017年，全球范围内有 1 000 万人罹患结核病，约160万人死于结核病[1]，并给社会经济的发展造成了巨大的负担。虽然全球有1/4的人口感染Mtb，但其中只有5%～15%的人会进展为活动性结核病[2]。人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染、免疫抑制剂使用等被认为是潜伏结核感染活化的重要危险因素[3]。

肠道菌群是人体微生态的重要组成部分，过去采用培养单一菌种研究肠道微生物的方法具有一定局限性。随着新一代测序技术的发展以及生物信息学分析工具的开发，肠道菌群被揭去了神秘的面纱[4]，其蕴含的基因是人类基因组的150倍[5]，可见其数目庞大，功能多样。本文就肠道菌群与结核病的关系、肠道菌群与结核病相互影响的可能机制、抗结核治疗对肠道菌群的影响等方面的相关研究进行综述。

1 肠道菌群概述

人体肠道内包含超过1014个细菌，有 1 000 多个种类，占主导地位的有6个细菌门：厚壁菌门、变形杆菌门、拟杆菌门、梭菌门、放线菌门和疣微菌门，其中拟杆菌门和厚壁菌门占肠道菌群组成的70%以上[6]。既往认为肠道菌群的第1次定植发生在分娩过程中，然而最近研究发现在羊水和胎盘中已经含有以变形杆菌为主的微生物群，因此推测肠道微生物的部分定植可能始于子宫内[7]。出生后，新生儿肠道菌群的进一步定植取决于最初几小时和几天内所接触的环境，如自然分娩新生儿的肠道被母体阴道和粪便中的细菌定植，主要是乳酸菌和双歧杆菌[8]，而剖宫产出生的婴儿暴露于母体、医护人员皮肤及医院环境中，因而肠道内以葡萄球菌为主的相关微生物定植[9]，因此分娩方式以及分娩环境可以影响人类早期肠道菌群的建立。随着年龄的增长，一般认为儿童肠道菌群组成在3年内向类似于成人肠道菌群组成转变[10]。在此过程中，喂养方式不同，肠道菌群的建立存在差异。相对于配方奶喂养的婴幼儿，母乳喂养的婴幼儿肠道内有较多的双歧杆菌，研究表明此菌可通过增加IgA的分泌来加强机体肠道黏膜免疫屏障，从而有助于机体抵抗外来病原菌的侵袭[11]。

肠道菌群有多种功能，可合成多种人体需要的物质，如维生素B、K等[12]，参与食物处理过程，包括消化多糖(淀粉、纤维素)、生产短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFA)等[13]。它们还参与组成肠道黏膜固有免疫屏障，抵抗外来菌的入侵。最为重要的是通过调节宿主淋巴结的成熟、肠道上皮功能及塑造T细胞亚群等方式促进机体免疫系统发育和成熟[14]。肠道菌群还可以产生许多化学介质，进入血液后与大脑、心脏和肝脏等远隔器官相联系。近几年产生的诸如肠-肺轴、肠-脑轴等理论，进一步表明了肠道菌群在人体健康与疾病中所扮演的重要角色[15-16]。

在正常生理状态下，肠道菌群与机体保持着动态平衡，但容易受到许多因素的影响，包括饮食、药物、疾病等[17]。当其与宿主之间的动态平衡被打破时，肠道菌群多样性和数量会发生变化，导致肠道菌群失调[18]。肠道菌群失调与一些疾病之间存在着密切的关系，如炎症性肠病、哮喘、肥胖、肿瘤等[19-20]。近几年肠道菌群与结核病之间的关系也受到了关注。

2 肠道菌群与结核病的关系

2.1 Mtb感染后宿主肠道菌群的变化

无论是在小鼠模型还是在人体中，Mtb感染都可引起肠道菌群多样性改变。在一项小鼠实验中，Winglee等 通过收集雾化吸入Mtb前后一定时间节点(感染前后1周、死亡前1周以及感染至死亡前每个月)的粪便标本，采用16S rRNA测序并进行肠道菌群分析发现，小鼠在Mtb的气溶胶感染后的第6天，肠道菌群多样性降低，主要是梭状菌和拟杆菌等优势菌群数量减少，而且这种变化与Mtb菌株无关。尽管5只小鼠的存活时间并不一致，但随着病程的延长，小鼠死亡前肠道菌群的多样性虽然逐渐恢复，但是仍不能达到感染前的水平[21]，表明Mtb感染可引起小鼠肠道菌群早期、快速、不可逆的改变。同样，在另一项临床研究中，研究人员采用相同的分析方法，发现与健康对照组比较，活动性结核病患者的粪便中粪杆菌属、罗氏菌属、考拉杆菌属、真杆菌属丰度升高[22]。Luo等研究团队进一步比较了新发结核病与复发结核病患者粪便中肠道菌群的变化，发现新发结核病组患者的粪便中，拟杆菌门中的普氏菌属、厚壁菌门中的粪球菌属、毛螺菌属和罗氏菌属丰度下降，而变形杆菌门、埃希菌、链球菌等有害菌群丰度升高，而复发的结核病患者肠道中表现出独特的微生物群，包括变形杆菌、肠杆菌门、肠杆菌科、蓝藻门等[23]。Huang等研究发现，结核病患者包括潜伏结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)患者肠道内双歧杆菌的丰度是降低的。但与前述小鼠模型研究不一致的是，该研究发现拟杆菌门丰度增加[24]。因此，Mtb感染可以导致宿主肠道菌群变化，且处在不同Mtb感染状态的患者，其肠道菌群变化不一样。在不同的研究中，菌群的变化有些差异，可能是标本量过少、肠道菌群本身庞杂、采样时间不同、测序方法及分析方法不同等多种因素均可影响肠道菌群的评价。由于分析肠道菌群尚缺乏统一的标准方法，这可能是目前不能对结核病患者肠道菌群变化做出规律性描述的原因。另外尚未见针对儿童结核病患者肠道菌群变化的相关研究，需要进一步探索。

2.2 肠道菌群失调与Mtb感染结局

肠道菌群失调也可以影响机体感染Mtb后的结局。同样在小鼠模型的实验中，研究者给小鼠口服抗生素致其肠道菌群失调，随后在小鼠肺部病理组织切片中观察到Mtb载量增高，肺部出现诸如肉芽肿及结节病变明显增多的现象，且Mtb播散到了肝脏、脾脏。通过粪便移植重建肠道菌群后，小鼠体内Mtb的增长和播散得到了控制[25]，说明肠道菌群在限制Mtb增殖和播散方面发挥重要作用。有研究发现肝螺杆菌的慢性定植可导致肠道菌群变化，同时感染Mtb后，小鼠肺部Mtb载菌量明显升高[26]。在另一项动物实验中，研究人员也得到了相似的结果，同时还发现肝螺杆菌感染抑制了Ad85A疫苗对Mtb感染的保护作用[27]。与肝螺杆菌相反，同时存在幽门螺杆菌及Mtb感染的猕猴患活动性结核病的可能性减小。而共感染幽门螺杆菌和Mtb的人群，处于LTBI状态的时间更长[28]，说明幽门螺杆菌与抗结核反应中的保护性免疫有关。由此得出某些与人体共生的慢性定植菌可能会影响机体感染Mtb后结局的结论。

3 肠道菌群与结核病相互影响的可能机制

3.1 免疫调节

如前所述，肠道菌群与结核病之间存在相互关系，主要通过宿主免疫系统产生。在Mtb感染宿主后，机体可产生一系列复杂的免疫反应，这个过程涉及多种免疫细胞及细胞因子(如CD4+T细胞、巨噬细胞、TNF-α、IFN-γ等)，尤其是CD4+T细胞，其分化的Th1/Th2细胞亚群可调节抗结核免疫反应的方向[29]。有研究表明，肠道菌群改变在Mtb感染导致的天然免疫阶段已出现，一些天然免疫细胞(如iNKT细胞、γδT 细胞等)发生了变化[30]。当机体处于获得性免疫系统激活状态时，肠道菌群的多样性降到最低，说明Mtb感染引起的全身及局部黏膜免疫反应是导致宿主肠道菌群变化的重要原因之一[21]。也有一些研究发现肠道菌群与某些免疫细胞及细胞因子水平有关。如在新发结核病患者肠道中，普氏菌、毛螺菌属的丰度与CD4+T细胞水平呈正比，与复发结核病患者中CD4+T细胞水平呈反比，该细胞是Mtb感染过程中介导保护性免疫反应的主要免疫细胞[23]。在Majlessi的研究中，肠道菌群失调的小鼠体内Th-1细胞下降，调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)水平升高。这些免疫细胞分别具有保护宿主及促进Mtb易感性的作用，该变化在对小鼠进行粪便移植后恢复了原有水平，而小鼠的结核病变也减少[25]。前述有研究发现肝螺杆菌定植导致的肠道菌群紊乱可致天然免疫失调，并行的亚临床慢性炎症和中性粒细胞数增加可能影响肠道黏膜组织内的稳态和局部免疫反应，此类改变最终均有利于Mtb增长[26]。与其相反，幽门螺杆菌感染可使机体IFN-γ和Th-1水平升高，增强机体对Mtb特异性抗原的免疫反应，从而有利于机体控制Mtb播散[28]。在炎症因子水平方面，活动性结核病及潜伏结核感染患者肠道内拟杆菌门丰度增加，该菌通过调节一些细胞因子的产生(如IL-6、IL-1β等)促进结核病患者体内的炎症反应，同时肠道中降低的双歧杆菌水平也增加了结核病的活动性[24]。由此可见，Mtb感染后可以通过影响机体的免疫反应使肠道菌群发生变化，而反过来，特定的肠道菌群与宿主免疫状态有关，肠道某些菌群丰度的变化也会通过改变免疫细胞水平而影响机体抵抗入侵病原体的结局。如果将结核病的发生、发展与某些菌群感染之间建立相互联系，也许会给Mtb感染相关性疾病的研究带来突破。

3.2 肠道菌群代谢产物

SCFA是指含有1～6个碳原子的有机羧酸，包含乙酸、丙酸、丁酸等。人体内大部分SCFA是结肠内特定的肠道细菌对膳食纤维和抗性淀粉等大分子多糖进行厌氧发酵产生的。除了作为肠道黏膜细胞的能量来源外，SCFA可通过直接抑制组蛋白去乙酰化调控基因表达，还可以通过G蛋白偶联受体发出信号调节机体代谢、炎症反应等[31-32]。在结核病患者体内，SCFA中的丁酸水平升高，同时伴有Tregs水平的上升，IFN-γ、TNF-α水平下降，这些变化有利于结核病的活化。另外丁酸和丙酸还可以抑制肠道胆固醇合成，影响宿主食欲，使其减少摄入而导致营养不良。这也是SCFA引起结核病活化的重要因素，所以肠道中产SCFA细菌增多被认为是造成结核病患者免疫功能损害的一个重要原因[23]。Lachmandas等也证实，糖尿病患者肠道菌群的改变使得血清 SCFA增高，最终致糖尿病患者结核病活化的可能性增大[33]。然而在Wingleek等和Luo等研究中，结核病患者肠道中梭状菌、拟杆菌、罗氏菌属等产SCFA菌群丰度却是下降的[21, 23]，似乎与前述研究不相符合，故仍需要进一步的研究。

SCFA可导致Mtb的扩散，然而另一种肠道菌群代谢产物——吲哚丙酸(indole propionic acid, IPA)被发现可抑制Mtb增殖。IPA是由产孢子梭状芽胞杆菌和其他肠道共生菌从芳香氨基酸色氨酸经脱胺而产生的，在小鼠实验中，它被证明会影响肠道屏障功能和全身免疫反应[34]。为进一步探索其与结核病的关系，Negatu等从化学、代谢及基因水平角度进行全面评估，发现IPA可模拟色氨酸(tryptophan, Trp)，成为色氨酸操纵子E(Trp operon E, TrpE)的变构抑制剂，因而可在TrpE催化步骤中阻断Mtb合成Trp，发挥抗Mtb的作用[35-36]，所以该团队提出IPA或许可以成为新型抗结核病药物或是目前抗结核病药物治疗方案的补充，为抗结核病药物的研制提供了新思路。

3.3 肺-肠轴

Mtb可以侵袭人体的多个脏器，其中肺是Mtb侵入人体的门户。过去，人们认为健康人的肺是一个无菌的环境，但目前许多研究表明肺也存在微生物群，它们主要是厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门和梭菌门[37]。肠道和肺之间存在一个重要的交叉，即肺-肠轴。在这个交叉中，肠道菌群扮演着重要角色。已有研究证实，肠道菌群中双歧杆菌和乳酸菌的减少与机体感染甲型流感病毒后免疫反应改变和肺损伤增加有关，原因是肠道菌群失调导致Toll样受体7信号通路组分的表达水平降低，造成机体细胞免疫反应以及某些T细胞亚群的免疫活性受损，从而导致机体对流感病毒的清除受阻[38]。由于囊性纤维跨膜转导调节子(cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR)基因突变导致的氯离子分泌异常及伴随的水、电解质转移障碍，使得肺囊性纤维化的患者肠道pH值改变，稠厚的分泌物改变肠道微环境，由此造成了肠道菌群失调[39]。在结核病患者中，肠道并不是Mtb感染的原发部位，但Mtb感染却引起了肠道稳态的变化。综合目前相关研究，推测肺-肠轴可能发挥以下作用：①肺-肠轴通过血液系统进行双向连接。微生物代谢产物、内毒素等进入血液，激活并调节免疫系统，影响机体对Mtb感染的免疫应答而发挥作用，此类代谢产物包括前述的SCFA等[23]。血液流经肝脏，在那里免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞等)被活化[40]，因此也参与了机体对Mtb感染的应答。②有研究观察到脓毒症患者出现急性呼吸窘迫综合征及多器官功能衰竭，与肠道细菌及细菌毒素入血引起炎症细胞因子分泌有关[41]，因此提出肠道菌群移位是肺-肠轴关系的一个重要机制。虽然肺部菌群与肠道菌群在某些组成上相似，但目前研究并没有观察到肺结核患者中存在明确的菌群移位表现。总之，目前研究结果仅表明肺-肠轴在肺结核与肠道菌群之间的作用可能与机体局部和全身免疫状态的改变有关[25-26]，具体的机制尚不完全明确，有待深入探索。

4 抗结核治疗对肠道菌群的影响

抗生素的应用会导致肠道菌群失调，这种影响随抗生素抗菌谱、剂量、治疗时间、给药途径、药物性质等不同而各异。结核病的治疗需要长期的抗结核联合用药，对药物敏感的Mtb标准治疗方案包括使用异烟肼(H)、利福平(R)、吡嗪酰胺(Z)、乙胺丁醇(E) 2个月，然后继续使用H和R 4个月。对于耐药结核病，抗结核治疗需要更长的时间，还要加用其他抗结核药物[1]，导致了肠道菌群紊乱。Hu等发现抗结核治疗1周后，小鼠的肠道菌群多样性发生了显著的降低[42]。Namasivayam等比较了未感染Mtb的小鼠、感染Mtb的小鼠采用H、R、Z方案治疗后的肠道菌群变化。与前述研究不同的是[21]，使用同一小鼠模型及测序方法，结果发现Mtb感染小鼠引起的肠道菌群变化并不明显，这也许可归因于分析方法的差异，而使用H、R、Z疗法确实导致了Mtb感染的小鼠肠道菌群紊乱，主要是厚壁菌门中的梭菌下降，且这种菌群紊乱在此研究中持续到停止抗结核治疗后至少3个月。他们还探索了单药，H、R、Z 3种药物两两组合对未感染Mtb的小鼠及感染Mtb 4周后的小鼠肠道菌群的影响，最终发现R是引起肠道菌群紊乱的主要驱动因素[43]，这与R为广谱抗生素的特性相符。采用同样的检测分析方法，Wipperman等发现使用H、R、Z、E方案抗结核治疗的活动性结核病患者，其肠道菌群多样性与未感染Mtb组或LTBI组的多样性差异并不显著，但肠道菌群的组成仍然发生了改变，如梭杆菌、普氏菌富集，而乳杆菌、瘤球菌、双歧杆菌减少，且影响相当明显。肠道菌群这种变化在有些患者体内持续至完成抗结核治疗1.2年后。当然这是人为规定的标本采集时间节点，也许该影响会随着采样时间的延长而得到不同的答案。另外，伴随着肠道菌群组成的变化，肠道内的代谢体系也受到影响，其中包括脂肪酸氧化及维生素合成增多，结合胆汁酸合成减少。这些改变的肠道细菌已被证实对全身免疫系统具有调节功能，再加上相应的代谢异常等，抗结核治疗可能会引起宿主免疫功能的受损[44]。尽管异烟肼/吡嗪酰胺对肠道菌群的影响作用较利福平小，但是由于异烟肼/吡嗪酰胺导致的肠道菌群失调会削弱肺泡巨噬细胞对Mtb的杀伤能力，因此会增加宿主再次患结核病的风险[45]。同时患者更容易被其他病原菌感染，这在1例泛耐药结核病患者的报道中得到证实，即该患者由于长期使用多种抗生素，肠道菌群失调十分严重(在其粪便涂片中几乎看不见细菌)，最终该患者死于链球菌感染导致的肺炎[46]。

相比较成人，儿童结核病治疗用药剂量高于成人，且儿童更容易受到生态失调的影响，早期使用抗生素导致的肠道菌群失调会增加儿童患哮喘、炎症性肠病等慢性疾病的风险[47-48]。但目前结核病药物治疗对儿童(包括婴儿)的微生物群影响尚不完全清楚，婴幼儿时期正是肠道菌群建立的重要时期，影响因素颇多。直至目前，世界范围内儿童结核病的负担仍然沉重，需要深入的研究以确定肠道菌群的紊乱、结核病药物的使用是否影响儿童结核病的进展。

5 展望

结核病与肠道菌群之间存在相互关系，两者之间可能通过免疫系统相互联系。如今肠道微生态制剂逐渐成为重要的辅助治疗手段，也许将来微生物制剂、粪便移植等方式可以辅助结核病的治疗。随着对肠道菌群的深入研究，对某些肠道菌群丰度的检测也许会成为结核病辅助诊断的生物学指标，甚至对新疫苗的研发也具有一定的帮助。另外，肠道菌群本身的形成受诸如分娩、喂养方式等因素的影响，进一步探究其对肠道菌群的影响与Mtb感染的相互关系也将是一个新的课题，也许可以从肠道菌群的建立着手，降低Mtb感染，为消灭结核病策略提供全新的思路。