枯草芽孢杆菌发酵脱脂麦胚自由基清除率研究

王敏，侯银臣，张明丹，刘亚楠，彭丹丹，刘娜*

(1.河南工业大学谷物资源转化与利用省级重点实验室，郑州 450001；2.河南工业大学 生物工程学院，郑州 450001；3.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046)

近年来，随着人们的营养需求越来越高，麦胚的营养成分及微量生理活性物质越来越受到重视[1]，广泛应用于焙烤食品、发酵饮料、豆制品、婴幼儿食品和其他营养食品中[2,3]。

目前抗氧化活性研究是国内外研究的热点。自由基清除即抗氧化的研究、开发及利用成为了现代科学发展的必要趋势。研究发现，天然植物中有许多的化学物质具有抗氧化活性，而这些天然的抗氧化剂分为植物源性抗氧化剂和动物源性抗氧化剂[4]。

有研究表明，发酵可以提高物质的抗氧化活性。如张友维等[5]利用枯草芽孢杆菌发酵花生粕制备抗氧化肽，提高了DPPH自由基清除率；吴泽柱等[6]利用枯草芽孢杆菌发酵玉米蛋白粉生产玉米肽，提高了抗氧化活性。张会等[7]研究表明，从米曲霉发酵的玉米胚芽粕中提取玉米胚芽蛋白，经对比发现发酵后抗氧化能力增强。利用微生物发酵，发酵液中的多肽分子量主要集中在1000 Da以下，并且发酵液对多种自由基都有一定的清除能力[8]，这为提高小麦胚芽的抗氧化活性提供了新思路。本文以小麦胚芽为原料，DPPH自由基清除率为指标进行响应面优化，选取最优发酵工艺，为后续工业化利用麦胚制造具有抗氧化活性的制品提供了依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦胚芽：由河南省鲲华生物技术有限公司提供；枯草芽孢杆菌：实验室保藏菌种；DPPH：合肥博美生物科技有限责任公司；其他试剂：均为分析纯。

1.2 试验仪器

UV2600S双光束紫外可见分光光度计 上海重逢科学仪器有限公司；GXZ-智能光照培养箱 宁波江南仪器厂；QYC-200全温培养摇床、电热恒温水浴锅 上海新苗医疗器械制造有限公司；高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司；MJ-78A高压灭菌锅 施都凯仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化和培养

参照文献[9]中的方法，将保藏完好的枯草芽孢杆菌在无菌状态下接种于灭菌过的LB固体斜面培养基中，置于37 ℃的恒温培养箱中，培养24 h进行菌种活化。将活化后的枯草芽孢杆菌接入灭菌过的种子培养基(PDB培养基)中，在37 ℃、150 r/min的条件下，培养24 h。经平板计数法测定菌种浓度为6×105CFU/mL[10]。

1.3.2 小麦胚芽培养液的制备

称量20 g小麦胚粉置于500 mL的锥形瓶中，按料液比加入一定量的水，搅拌均匀，并对其进行高温杀菌处理。冷却至室温加入活化后的枯草芽孢杆菌，置于37 ℃摇床上按照所需时间培养。

1.3.3 小麦胚芽发酵产物的单因素试验

其他条件不变，以发酵时间、料液比和菌种接种量为自变量，小麦胚芽DPPH自由基清除率为因变量，确定麦胚发酵工艺最佳条件[11]。

1.3.4 小麦胚芽DPPH自由基清除率的响应面试验设计

根据Box-Behnken设计原理，在单因素试验的基础上，以发酵时间、料液比和菌种接种量为3个因素，DPPH自由基清除率为响应值，进行三因素三水平试验设计[12]。

1.3.5 抗氧化活性的评价

DPPH自由基清除率的测定方法参照文献[13,14]进行。 吸取1 mL发酵液于100 mL容量瓶中稀释100倍。吸取稀释液2 mL加入试管中，再添加0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，摇匀静置30 min后，在517 nm处测定吸光值。

(1)

式中：A0为空白吸光值(2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇)；A试样为样品吸光值；A对照为对照组吸光值(2.0 mL无水乙醇样品溶液与2.0 mL无水乙醇)。

发酵液稀释100倍后，超氧阴离子自由基清除率的测定方法参照文献[15]进行；羟基自由基清除率的测定方法参照文献[16]进行；ABTS+自由基清除率的测定方法参照文献[17]进行。

2 结果与分析

2.1 小麦胚芽发酵产物的单因素试验

2.1.1 发酵时间对 DPPH 自由基清除率的影响

在温度37 ℃，枯草芽孢杆菌接种量5%，发酵初始pH 6，料液比1∶10时，考察发酵时间对DPPH自由基清除率的影响，见图1。

图1 不同发酵时间对DPPH 自由基清除率的影响Fig.1 Effect of different fermentation time on the scavenging rates of DPPH free radical

由图1可知，当发酵时间小于36 h时，DPPH自由基清除率变化缓慢。36～48 h时DPPH自由基清除率持续增加，在发酵48 h时DPPH自由基清除率达到最大值，为61.41%，比发酵前增加了37.93%。随后DPPH自由基清除率又逐步减小。说明具有活性的肽被过度发酵成没有活性的肽和氨基酸。故可以确定最优发酵时间为48 h，此时DPPH自由基清除率最佳。

2.1.2 发酵中培养基料液比对 DPPH 自由基清除率的影响

在温度37 ℃，枯草芽孢杆菌接种量5%，发酵初始pH 6，发酵时间48 h时，考察发酵培养基料液比对发酵麦胚DPPH自由基清除率的影响，见图2。

图2 发酵培养基料液比对 DPPH 自由基清除率的影响Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid of fermentation medium on the scavenging rates of DPPH free radical

由图2可知，当料液比为1∶11时，DPPH 自由基清除率达到最大值68.96%，水分的增加使枯草芽孢杆菌能更好地利用发酵培养基中的营养物质。随着料液比继续增大，由于营养物质的消耗和代谢物质的堆积，DPPH自由基清除率下降。因此，料液比1∶11时DPPH自由基清除率最佳。

2.1.3 不同接种量对 DPPH 自由基清除率的影响

在温度37 ℃，发酵初始pH 6，料液比1∶10，发酵时间48 h时，考察不同接种量对发酵麦胚DPPH自由基清除率的影响，见图3。

图3 不同接种量对DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of different inoculation amount on the scavenging rates of DPPH free radical

由图3可知，当接种量为3%时，DPPH 自由基清除率达到最大，为65.25%。当菌种接种量大于3%时，发酵液中的DPPH自由基清除率反而下降，且降低幅度远大于上升幅度。可能是由于枯草芽孢杆菌的大量存在，使一些原本具有活性的多肽被进一步水解成没有活性的肽，因此应严格控制菌的添加量。当接种量为3%时DPPH自由基清除效果最佳。

2.2 小麦胚芽DPPH自由基清除回归分析

依据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计原理，选取菌种接种量、发酵时间和料液比作为3个因素设计三因素三水平试验，结果见表1。

表1 Box-Behnken试验方案及结果Table 1 Box-Behnken test scheme and results

为了考察影响小麦胚芽DPPH自由基清除率的各因素之间的交互性，通过Design-Expert v8.0.6软件对数据进行分析，拟合出的二次多项回归方程为：

Y=71.89+1.96A+1.64B+3.40C-1.00AB-1.96AC-2.72BC-12.21A2-9.12B2-4.66C2。 (2)

由表2可知，F值为47.22，表示该模型有意义；P<0.0001，极显著，表明该模型具有统计学意义；回归方程的R2=0.9838，表明试验拟合度较好，为98.38%；Adeq Precision(信噪比)为18.844(>4)，表明该模型可用于数据分析。0.8006的“RPred2”与0.9630的“ RAdj2”在合理范围内，表示方程的拟合性非常好，可用此模型对试验进行分析[18,19]。

表2 发酵麦胚中DPPH自由基清除率的回归模型方差分析Table 2 The regression model variance analysis of DPPH radical scavenging rates in fermented wheat germ

由图4～图6可知，所有响应面交互图呈凸起状，响应面可以直观地反映各因素对响应值的影响。响应面交互图坡度越大表明DPPH自由基清除率的变化越快，即更为显著。此外，等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形与之相反。

图4 料液比和发酵时间对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid and fermentation time on the scavenging rates of DPPH free radical

图5 料液比和接种量对DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid and inoculation amount on the scavenging rates of DPPH free radical

图6 发酵时间和接种量对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effects of fermentation time and inoculation amount on the scavenging rates of DPPH free radical

通过分析可知，DPPH自由基清除率随着各因素先增加，达到最大值后减小或保持平衡。一次项料液比(A)、发酵时间(B)和接种量(C)都对DPPH自由基清除率有显著性，且影响顺序为接种量(C)>料液比(A)>发酵时间(B)。发酵时间(B)和菌种接种量(C)之间的交互性对发酵麦胚DPPH自由基清除率的影响有显著性。通过响应面得出的最优因素组合是料液比1∶11.7、发酵时间48.3 h、菌种接种量3.2%。

2.3 响应面验证

通过响应面优化得到的最优因素组合是料液比1∶11.66、发酵时间48.25 h、菌种接种量3.22%，此条件下DPPH自由基清除率为68.13%。考虑实际操作情况，将条件修定为料液比1∶11.7、发酵时间48.3 h、菌种接种量3.2%。为了验证模型的准确性，在此条件下经3次平行试验，得到DPPH自由基清除率为69.54%，与理论值68.13%的相对误差为0.997%(<5%)，所以响应面优化得到的条件参数准确，具有可靠价值。

2.4 最优因素组合测量结果

工艺优化得出的最优因素组合是料液比1∶11.7、发酵时间48.3 h、菌种接种量，此时DPPH自由基清除率为69.54%，较发酵前提高了46.07%。经离心后取上清液做3个平行试验，测量羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基清除能力分别为14.44%、18.72%和68.74%。

3 结论

本文以自由基清除率为指标确定料液比、发酵时间和菌种接种量3个因素对小麦胚芽DPPH自由基清除率的影响。通过设计响应面得出DPPH自由基清除率的Box-Behnken，得出各因素对多肽制备的影响顺序为接种量>料液比>发酵时间。确定枯草芽孢杆菌发酵小麦胚芽制备多肽的最优发酵条件为料液比1∶11.7、发酵时间48.3 h、菌种接种量3.2%，在此条件下发酵麦胚的DPPH自由基清除率为69.54%，较发酵前提高了46.07%。羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基清除率分别为14.44%、18.72%、68.74%。