一例波尔山羊口疮病的实验室诊断

●史冠英 王 涛※ 徐 敏 刘文伟 张 震

（1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心新疆乌鲁木齐830063；2.新疆农业大学新疆乌鲁木齐830063）

羊口疮又称羊传染性脓疱[1]，是由羊口疮病毒引起的绵羊和山羊的一种接触性传染病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征[2]。口蹄疫病毒(FMDV)属于小RNA病毒科，羊通过接触病羊或病羊排泄物感染[3]。羊感染口蹄疫发病后一般不致死，但会使病羊的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退。羊痘（Qrf）是由羊痘病毒所致，羊痘病毒是一种对乙醚敏感的脱氧核糖核酸（DNA）病毒，该病毒主要侵染羊[4]，人接触病羊或病羊污染的物质也会被感染，因此羊痘是一种人畜共患病[5]。以上这三种传染病羊均易感，且表现出的临床症状极为相似，有时很难在临床上做出区别[6]，这也是基层兽医在开展工作时经常会遇到的瓶颈。本文以实验室诊断的方法确诊了一例疑似感染羊口疮病毒的病例，将临床症状和实验室诊断结合起来对疾病做出确诊，旨在为基层兽医工作者在疾病诊断方面提供科学依据，使农牧民避免遭受大的经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂加抗生素（庆大霉素、左旋氧氟沙星、阿奇霉素）的PBS-甘油棉拭子保存液（pH7.2-7.6）；哈尔滨元亨生物药业有限公司提供的柱式核酸提取试剂盒，批号：YRNA-TQ 20190926P；洛阳莱普生信息科技有限公司提供的口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，批号：CP20190612；羊痘病毒荧光PCR检测试剂盒，批号：XP20190912；羊口疮病毒荧光PCR检测试剂盒，批号：WP20191112。

1.1.2 仪器高速冷冻离心机购自德国Sigma公司，型号：3K15；实时荧光定量PCR仪购自美国赛默飞公司，型号：QuantStudio 5；电热式恒温水浴锅购自北京市医疗设备有限公司，型号：DM0421；可调式漩涡振荡器购自大龙器械有限公司，型号：MX-S；瞬时离心机购自美国ABI公司，型号：MinX-5；全自动组织研磨仪购自法国BERTIN公司，型号：PEVO62。

1.1.3 样本病原学样本：该养殖户共饲养89只波尔山羊，与发病羊只同圈的有26只，其中仅1只羊表现出临床症状，具体症状表现为在口、唇、鼻附近有丘疹、水疱样结节。采集水疱皮3份、水疱液2份，放入1.5ml离心管内，置于有冰袋的采样箱内，及时送至实验室。

棉拭子样本：对发病羊只所在圈舍分点采集10份环境棉拭子样本，对病羊接触过的采食槽、饮水槽及围栏分点采集10份棉拭子样本，采集后的样本放在装有冰袋的采样箱内，送至实验室。

1.2 方法

1.2.1 样本灭活将采集的水疱皮、水疱液及环境棉拭子样本放入恒温水浴锅中56℃，30min灭活。

1.2.2 病毒核酸提取将水浴锅中的病原学样本及棉拭子样本取出后，置于振荡器充分震荡，3份水疱皮经全自动组织研磨仪研磨、混匀后，高速冷冻离心机12 000r离心1min，收集上清液，参照柱式核酸提取试剂盒说明书进行核酸提取，提取后的核酸放置于20℃的条件下保存待检测。

1.2.3 病原学样本羊痘、羊口疮及通用型口蹄疫病毒核酸检测

将提取的病毒核酸按照羊痘、羊口疮及通用型口蹄疫病毒荧光定量检测剂盒说明书配制反应体系、设置荧光PCR仪程序，收集检测结果。

1.2.4 环境棉拭子样本羊痘、羊口疮及通用型口蹄疫病毒核酸检测

将提取的核酸按照羊痘、羊口疮及通用型口蹄疫病毒荧光定量检测剂盒说明书配制反应体系、设置荧光PCR仪程序，收集检测结果。

2 结果与分析

2.1 羊痘病毒核酸检测结果

图1 羊痘病毒核酸荧光PCR检测结果

共采集25份病原学样本，其中3份水疱皮、2份水疱液、20份环境棉拭子样本，经检测羊痘病毒核酸均为阴性，具体结果见图1。说明该病羊表现出的临床症状不是羊痘病毒引起的，应结合其他两种可能进行鉴别。羊痘具体的临床症状表现为初起为红色或紫红色的小丘疹，质地坚硬，以后扩大成为顶端扁平的水疱、后扩大成扁平出血性大疱或脓疱，中央可有脐凹并结痂，大小为3～5cm。波尔山羊感染羊痘后临床症状有一个发展的过程，典型的症状才能表现出来。水疱皮呈淡褐色，这与口蹄疫病毒具体临床症状有细微的差异，这也可能是在临床上这两种病的根本区别。

2.2 通用型口蹄疫病毒核酸检测结果

共采集25份病原学样本，其中3份水疱皮、2份水疱液、20份环境棉拭子样本，经检测羊口蹄疫病毒核酸均为阴性，具体结果见图2。说明该病羊表现出的临床症状不是羊口蹄疫毒引起的，应结合羊口疮病毒进行鉴别。羊感染口蹄疫病毒后，一旦出现水疱结痂，病羊体温会在短时间内升高，初期体温可达40～41℃，精神沉郁，食欲减退或拒食，脉搏和呼吸加快。口腔、蹄和乳房等部位出现水疱、溃疡和糜烂。

图2 通用型口蹄疫病毒核酸荧光PCR检测结果

2.3 羊口疮病毒核酸检测结果

共采集25份病原学样本，其中3份水疱皮、2份水疱液、20份环境棉拭子样本，经检测5份组织样本羊口疮病毒核酸均为阳性，20份环境棉拭子样本中均未检测到羊口疮病毒，具体结果见图3。从检测结果可以看出，该羊确实感染了羊口疮病毒，但暂未对圈舍环境造成污染，此时应尽早予以隔离并实时观察，将健康羊只从该圈舍移除，并对圈舍进行整体消毒。

图3 羊口疮病毒核酸荧光PCR检测结果

3 讨论

本文采用分子生物学方法，通过实验室诊断的手段对羊痘、羊口疮及羊口蹄疫三种病毒进行鉴别[7，8]，最终确诊为羊口疮病毒。虽然在圈舍环境中未检测到羊口疮病毒，但建议该养殖户首先应第一时间隔离病羊，将同群其他健康羊只移出该发病圈舍，并对圈舍进行全面彻底地消毒。消毒剂可选用含有效氯制剂、含有效溴消毒剂及强碱消毒剂，如二溴海因、葵甲溴氨、84消毒液等消毒，全面喷洒或浸泡饮水槽、采食槽等有可能被病羊污染的器具。将隔离病羊的排泄物进行集中消毒，尿液及其他液体污染物可采用生石灰、二溴海因进行浸泡1～2h消毒，粪便及其他固体可采用葵甲溴氨、84消毒液等喷洒消毒，作用30min以上。