去势法构建骨质疏松症模型大鼠肱骨与股骨骨组织形态计量学比较

刘月姝 江国健 梁志健

（广东省医学实验动物中心，广东佛山 528248）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种系统性骨病，原发性骨质疏松症以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数量减少，骨皮质多孔、变薄为特征[1]。构造实验动物骨质疏松症模型有多种方法，其中，去势法最为常用的方法[2]。骨组织形态计量学、简称骨计量学，近年来被广泛用于骨质疏松等代谢性骨病发生机制、药效学及各种防治手段的研究[3]。本试验选择去势SD大鼠骨质疏松症模型动物，比较肱骨及股骨的组织学、及骨组织计量学是否存在差异，以便在动物实验中选择最佳部位用以评价骨质疏松症模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雌性3月龄SPF级SD大鼠20只，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2018-0002。动物实验经中心实验动物伦理委员会审查批准。动物随机分为2组，假手术组、模型组，各组10只动物。

1.2 主要试剂

注射用青霉素钠，华北制药集团动物保健品有限责任公司，批号1809 8，石蜡，广东大川特种蜡有限公司，批号：20191013，环保透明剂，武汉宏兹生物技术有限公司，批号：2020010602，无水乙醇，广州化学试剂厂，批号：2019120213，曙红（醇溶），国药集团化学试剂有限公司，批号：20190820，苏木素，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10529154，甲醛溶液，西陇科学股份有限公司，批号200417 2。

1.3 主要仪器

BS-3000A型电子天平，上海浦春计量仪器有限公司，感量：0.1g；ASP300S型生物组织全自动脱水机，LEICA，德国；EG1150型生物组织包埋机，LEICA，德国；AutoStainer-XL型自动染色机：LEICA®，德国。BX43型生物显微镜：OLYMPUS，日本。CellSens Standard显微图像软件：OLYMPUS，日本。

1.4 实验方法

1.4.1 去势手术方法

腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，注射体积为1.5ml/kg。俯卧位于手术板上，背部中下部皮肤备毛，75%乙醇消毒，背部中下部作1～2cm纵行切口，止血钳伸入切口向两侧进行钝性分离，使背部皮肤与肌层分离。移动切口，使切口位于左右两侧腹后壁肌肉层较薄处打开腹腔，切口尽量小，暴露乳白色条带状脂肪团，于其中找出淡红色卵巢。0号缝合线于卵巢和子宫的连接处结扎，另结扎卵巢下方脂肪团，避免剪除卵巢时伤及脂肪团里血管，引起出血。结扎后剪除卵巢，将子宫轻轻置回入腹腔，逐层缝合，碘伏消毒创口。假手术组动物不摘除卵巢，只剪除卵巢周围的脂肪组织，大小与卵巢相当即可，其余操作同上。术后动物肌肉注射青霉素注射液，8万单位/只，连续注射3d，以防动物术后感染。术后常规饲养12周。

1.4.2 组织学评价方法

实验结束，麻醉放血处死动物，解剖取出左侧肱骨及股骨，用纱布除去骨干周围附着的肌肉组织后用4%中性甲醛固定72h以上。使用Plank-Rychlo脱钙液脱钙，脱钙后的骨组织经手捏富弹性、用取材刀的刀锋轻刮骨髓表面无沙沙声时脱钙结束，留取肱骨及股骨近端、取正中矢状面经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片（厚度3μm）、HE染色后，于光学显微镜下观察骨组织形态。

1.4.3 骨组织计量学参数测定方法

选取骨骺生长板以下1～3mm范围的区域拍摄40×照片，使用显微图像软件测量骨组织面积（T.Ar）、骨小梁面积（Tb.Ar）以及骨小梁周长（Tb.Pm），按照计算公式计算骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁数量以及骨小梁分离度。

表1 骨组织计量参数计算公式[4]

1.5 统计学方法

所有数据以均数±标准差（M±s）表示，应用SPSS22.0软件进行统计分析，采用独立样本T检验，P＜0.05时差异显著，P＜0.01时差异极显著。

2 结果

2.1 病理组织学变化（图1）

假手术组动物肱骨及股骨结构基本正常，骨皮质未见变薄，骨小梁致密，骨髓腔大小正常，高倍视野下，骨小梁周围可见成骨细胞、偶见或未见破骨细胞。模型对照组动物肱骨及股骨骨皮质变薄、股骨变化更明显，肱骨及股骨骨小梁变细、断裂不连续、数量减少、排列稀疏，骨髓腔扩大、骨髓脂肪组织增生，高倍视野下，骨小梁周围成骨细胞减少、易见破骨细胞。

2.2 骨计量学参数结果

术后12周，肱骨及股骨的模型组骨组织计量学参数较假手术组可见明显变化：其中，骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁数量极显著（P＜0.01）下降，骨小梁分离度极显著（P＜0.01）升高。肱骨与股骨之间比较：可见假手术组骨小梁面积百分数存在极显著（P＜0.01）差异、骨小梁分离度存在显著（P＜0.05）差异，假手术骨小梁厚度和骨小梁数量未见显著差异（P＞0.05）；模型组骨小梁面积百分数、骨小梁数量、骨小梁分离度存在极显著（P＜0.01）差异。

图1 各组大鼠肱骨及股骨组织病理学变化（-1：HE ×40，-2：HE ×400）

表2 骨计量学参数比较（n=10）

3 讨论

临床上，绝经后骨质疏松症是危害人类健康的常见病之一。骨质疏松症的发生是由于骨细胞活动失衡，破骨作用大于成骨作用，致使总骨量降低，从而导致骨骼强度降低，临床表现为骨折风险增加，骨骼畸形、严重疼痛，有时甚至引起死亡[5]。构建骨质疏松症动物模型最常用的方法是去势法，尤其在雌性动物，能够看到更好的造模效果[6]。这是因为雌性动物经手术去势，由于体内雌激素含量降低、破骨细胞受到的抑制作用减弱，最终因破骨作用大于成骨作用而使得骨组织微结构发生变化，骨质丢失、骨量减少，出现类似于临床所见的女性绝经后骨质疏松症的一系列变化[7]。

治疗骨质疏松症的药物，主要包括钙剂、维生素D、抗消化剂如雌激素、双膦盐酸，以及合成类固醇，但这些药物在实现治疗效果的同时也会有一系列副作用[8]，因此，寻找更好的药物以期治疗或者预防骨质疏松症，成为骨质疏松症研究的热点。判断药效及药物安全性，首先需要通过动物实验来实现，而去势大鼠骨质疏松症模型是常用的实验动物。在动物实验中，为了获得更多指标作为判断依据、同时遵循动物实验的“3R”原则，不少研究者会选择同一例动物不同部位的骨组织去做不同的指标检测，选择的部位通常有肱骨、股骨、胫骨、椎骨等，检测的内容有骨密度、骨钙等元素、骨组织学、骨计量学、骨生物力学等。其中，股骨和肱骨为常选部位、骨松质组织计量学静态参数为常测指标[9-19]。

骨计量学，属于体视学、生物医学组织形态计量学的特殊分支之一，该方法能够将形态学观察到的骨组织结构改变，转化为定量的参数，从静态和动态两个方面评价骨组织的变化、精确反映骨重建过程的变化规律和特点[20]。骨计量学参数中的骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁数量以及骨小梁分离度属于骨松质组织计量学静态参数，是反映骨组织形态结构及骨量变化的重要指标。骨小梁面积百分数反映骨量的多少，用以评价骨量变化，骨小梁厚度以及骨小梁数量都反映骨小梁形态结构、间接反映了骨量的变化，骨小梁分离度反映了骨小梁之间的平均距离、即骨小梁的疏密程度。

本试验中，雌性SD大鼠去势手术后12周，肱骨及股骨的组织学检查结果和骨计量学测定结果均反映了模型动物骨量减少、骨质丢失，再次验证了去势构建SD大鼠骨质疏松症模型方法具有高效、稳定的特点。假手术组，股骨骨小梁面积百分数和骨小梁分离度明显低于肱骨、存在统计学差异，说明股骨骨松质骨量、骨松质密度可能在造模之前就低于肱骨。造模后，除以上两个参数外、股骨的骨小梁数量亦明显低于肱骨、可见统计学差异，结合组织学见到的骨小梁变细、断裂等变化，可推断造模后12周，股骨的结构变化更为明显、骨量丢失更为严重，由此可见不同部位长骨的骨重建过程本身存在明显差异、造模后的变化亦存在明显差异，这一现象对药效试验的结果判定可能有潜在影响。在同等条件下，变化明显的部位，更适于评价药效。

综上所述，本试验证明采用去势法构建的雌性大鼠骨质疏松模型，在造模后12周，股骨的骨组织计量参数变化较肱骨更为明显，评价药效时可优先选择股骨作为检测骨组织计量参数的对象。