miR-223-5p、BMP4与大鼠脊髓损伤的相关性分析

彭川 胡明亮 李圣杰

【摘  要】目的：分析miR-223-5p、BMP4与大鼠脊髓损伤的相关性;方法：选取40只标准大鼠，随机分为观察组和对照组，每组各20只。观察组大鼠采用Allens法制备，对照组仅暴露脊髓。分别观察两组大鼠在术后2h、6h和12h的脊髓损伤情况。其中，miR-223-5p进行基因扩列，观察其转录有的TNFR1 和 DR6靶向蛋白，分析两组大鼠的miR-223-5p、BMP4阳性表达率;结果：观察组随着损伤时间的延长，受损脊髓段神经元的水肿、纤维消失程度加剧，且出现出血性的囊腔，且上述指标的严重程度明显高于对照组。同时，两组大鼠受损脊髓段的TNFR1 、DR和BMP4阳性率显著上述，观察组的上述率高于对照组，存在显著差异（p<0.05）。结论：minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4与大鼠脊髓损伤程度正相关，可以作为SD大鼠脊髓损伤的提示指标。

【关键词】脊髓损伤;靶向蛋白;miR-223-5p;BMP4

【中图分类号】R651      【文献标识码】A      【文章编号】1672-3783（2020）08-0045-02

脊髓损伤是受损段出现神经细胞凋亡，不能正确传输外界刺激信号。实验研究显示：miR-223-5p信号通路是神经信号传输的介质[1]，但其与损伤神经间的相关性尚不明确。又有研究显示，BMP4（transforming growth factor β，TGF-β）参与脊髓损伤后的炎症反应，是受损组织坏死的反应，但其参与的程度尚不明确。基于上述原因，本文以miR-223-5p和BMP4为研究对象，分析两者与大鼠脊髓损伤的相关性。

1.材料与方法

1.1材料

选择40只SD雄性大鼠，随机分为两组，每组各20只。两组大鼠的年龄、体重等方面资料无显著差异，可以进行统计学分析。

1.2脊髓损伤模型制备

两组大鼠采用不同的制备方式，观察组先对大鼠进行1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉，对其T10棘突位置进行切口，分离周围肌肉。同时，用直蚊式有齿血管钳对棘突和两侧椎板进行破坏，充分暴露硬脊膜，并用重物打击硬膜囊造成脊髓损伤;对照组仅进行脊髓暴露，但不进行重物击打两组大鼠制备完成后[2]，进行单笼饲养，人工排尿。

1.3实验方法和指标

两组大鼠分别采用和PCR染色检验，对比大鼠的脊髓损伤程度，以及神经元水肿和神经纤维消失情况。其中，下肢运动功能评分以倾斜板评分和改良的Tarlov评分为主，倾斜板评分分值为1～5分，分值越高代表受损越严重;Tarlov评分分值为1～50分，分值越低代表受损越严重。

1.4统计学分析

利用Spss17.0统计软件和Excel软件进行分析。其中，计量采用x ?±s，计数的独立样本t检验。p<0.05代表存在显著差异。

2.结果

2.1两组大鼠的下肢运动评分

观察组的IP评分和Tarlov评分均逊于对照组，存在显著性差异（p<0.05），结果如下表所示：

2.2 miR-223-5p、BMP4与损伤程度

观察组中大鼠的miR-223-5p的与其转化的靶向蛋白，以及BMP4的阳性率与脊髓损伤之间存在显著正相关（r=2.823，p=0.021），存在显著差异，具有统计学意义。

3.讨论

基础实验结果显示：脊髓受损后，脊髓灰质与白质区的神经元受损程度不同。白质区域神经元损伤主要是由于继发损伤所致。又有临床研究显示，继发性脊髓损伤所致的神经细胞损伤经历水肿、坏死和凋亡等过程，BMP4是白质区域神经元凋亡的主要蛋白。在白质神经元损伤过程中，分泌大量神经影响因子TNFR1、DR6，所以对影响因子的分析和检测，可以判断损伤的位置和原因，更好地为临床治疗提供帮助[3]。

3.1 脊髓损伤释放大量miR-223-5p、BMP4

对照组大鼠脊髓组织相对比较密集，细胞核比较大，染色比较浅，且内核清晰。大鼠脊髓损伤后12h，出现片状出血，且呈现坏死性囊腔，神经元水肿明显，组织间隙较大，组织间的胶质细胞溶解，从影像学证实大鼠脊髓出现损伤。TNFR1、DR6是miR-223-5p转录后的靶向蛋白，基础研究结果显示，上述蛋白参与神经细胞的增殖、凋亡和分化，从基因角度证实大鼠脊髓出现损伤。BMP4属于转化生长因子-β范畴，是小胶质细胞增殖和活化的反应，出现于組织的炎症反应后。脊髓损伤后出现一定的严重，受损组织周围细胞坏死，凋亡，释放大量的BMP4。本文研究结果显示，观察组大鼠的BMP4量显著高于对照组，进一步说明脊髓损伤与BMP4有关。同时，部分研究结果显示，神经组织损伤，或者缺血性损伤，会导致受损组织出现磷酸化，增加BMP4的释放量。两组大鼠在12h后，miR-223-5p释放量增加，导致TNFR1、DR6的阳性率提高，而且组织的磷酸化使得BMP的释放量进一步增强。由此可知，大鼠脊髓发生继发性损伤后，TNFR1、DR6和BMP4的释放量增加，进而阳性率提高。

3.2 miR-223-5p、BMP4促使损伤加剧

研究结果显示，两组大鼠的3h、6h和12h 后miR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR6， 以及BMP4均呈现增加趋势，说明大鼠脊髓损伤后，炎症反应逐渐增强。已有研究表明，在神经元损伤后，胶质细胞的凋亡加快，致使miR-223-5p转录表达增强，TNFR1、DR6的阳性率升高。研究的结果发现：在大鼠脊髓损伤3h时，观察组和对照组的miR-223-5p的表达增加量差异较小，而在6h、12h时增加量飙升。同时，伴随TNFR1、DR6表达的增强，BMP的表达也随之急剧增加， 初步证实TNFR1、DR6与BMP4参与脊髓神经细胞的凋亡，与继发性脊髓损伤相关。另外一个方面，脊髓损伤会增加周围组织的磷酸化，使得BMP4的活性受到抑制，使得胶质细胞的增殖和活化能力减弱，进一步促进组织凋亡，增强损伤后的炎症反应。大鼠的脊髓受损后，血液中炎性细胞数量激增，而炎性细胞与内皮细胞产生会产生活氧化物（ROS，reactive oxygen species）和炎性因子，本文研究结果中TNF-α、IL-1β和BMP4随着大鼠脊髓损伤的加剧，三者的阳性率显著提高。国内研究结果显示，TNF-α、IL-1β是神经炎凋亡、脊髓白质的主要炎性介质，而且TNF-α与BMP4的结合，可以活化RIP1复合物参，使得脊髓受损组织出现再灌注血，增加组织内的炎性因子量。所以，本研究中，观察组大众的miR-223靶向蛋白TNF-α和IL-1β阳性率激增。另外，有研究结果显示，BMP4是神经元组织间胶质消失的标志物，所以观察组的BMP4在3h、6h和12h阶段量显著增加，而且在12h的增加量激增，提示随着损伤的延长，脊髓中的神经元、神经纤维消失加快。12h时出现血液再灌注的问题，进一步增加组织的炎症因子量，促使神经细胞消亡，加剧神经组织的损伤。

综上所述，minR-223-5p的靶向蛋白TNFR1、DR和BMP4与大鼠脊髓损伤程度正相关，可以作为SD大鼠脊髓损伤的提示指标。

参考文献

[1] 满朝来， 杨美玲. 体液循环microRNA的研究进展[J]. 中国生物工程杂志， 2014， 34（2）： 104-108.

[2] Koudstaal S， Oerlemans MI， Van der Spoel TI， Janssen AW， Hoefer IE， Doevendans PA，Sluijter JP， Chamuleau SA. Necrostatin-1 alleviates reperfusion injury following acutemyocardial infarction in pigs[J]. Eur J Clin Invest . 2015; 45：150-9.

[3] Linkermann A， Br?sen JH， Darding M， Jin MK， Sanz AB， Heller JO， De Zen F， Weinlich R，Ortiz A， Walczak H， Weinberg JM， Green DR， Kunzendorf U， Krautwald S. Twoindependent pathways of regulated necrosis mediate ischemia-reperfusion injury[J].Proc Natl Acad Sci U S A . 2013，22（15）：110：12024-9.

垫江县技术研发与示范应用项目，项目名称：miR-223-5p通过BMP4调节神经干细胞分化在脊髓损伤修复中的研究，项目编号：djkjxm2018jsyfysfyy031