分子标记辅助选择Pi9基因改良湘晚籼11号的稻瘟病抗性

李枳蒙，张 婷，李 典，黄 俊，赖怡帆，吴婷婷，李博文，刘雄伦，2，3*

(1 湖南农业大学农学院，长沙 410128；2 作物基因工程湖南省重点实验室，长沙 410128；3 水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室，长沙 410128)

水稻(Oryzasativa)是我国乃至世界最主要的粮食作物之一，地球一半以上人口以稻米为食。由子囊真菌Magnaporthegrisea引起的水稻稻瘟病严重危害水稻正常的生长发育，影响稻米产量和品质，稻瘟病爆发年份可造成10%～30%的产量损失，严重时甚至绝收[1，2]。目前，防治稻瘟病的主要途径是化学防治和种植抗病水稻品种，但化学防治成本较高且不环保，培育和推广抗瘟水稻新品种是降低稻瘟病危害的上策[3，4]。稻瘟病抗性属典型的质量—数量性状，利用已克隆或精细定位的主效抗性基因，开发高效分子标记进行辅助选择，能最大限度地提高稻瘟病抗性育种的效率[5，6]。Pi9是一个广谱持久抗稻瘟病基因，来源于小粒野生稻(Oryzaminuta)，经远缘杂交导入到籼稻品系75-1-127，被定位在水稻第6号染色体的Pi2/9位点且被成功克隆[7，8]。本研究以75-1-127为Pi9基因供体亲本，以高感稻瘟病的优质常规晚稻品种湘晚籼11号为受体亲本及轮回亲本，利用Pi9基因特异高效分子标记，开展标记辅助选择育种实践，改良湘晚籼11号的稻瘟病抗性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻材料：Pi9基因供体亲本75-1-127；受体及轮回亲本湘晚籼11号；感病对照品系及稻瘟病诱发品种CO39。

稻瘟菌菌株：来自国内外不同稻区的24份稻瘟菌菌株，用于室内人工接种。

1.2 稻瘟病抗性表型鉴定及抗菌谱分析

室内接种抗性鉴定和抗菌谱分析：将水稻材料75-1-127、湘晚籼11号、CO39播种于育秧基质，26～28 ℃生长至4叶期，用0.2‰的 Tween 20水溶液将稻瘟菌菌株分生孢子配成浓度约1×105个/mL的悬浮液，活体喷雾接种；接种后用黑布覆盖，于26 ℃、相对湿度>90%条件下培养24 h后，继续在同温湿度、12 h光照下诱导发病5～7 d；当CO39叶片出现明显病斑时观察统计各材料抗性表型，参照文献[9]中苗瘟调查分级标准，将0～2级划分为抗病类型，3～5级划分为感病类型，并计算各供试材料对不同菌株的抗性频率(抗性频率=接种后不致病菌株数÷接种总菌株数×100%)。

田间病圃抗性鉴定：5月中旬将供试水稻材料和诱发品种CO39浸种催芽后播于湖南浏阳大围山自然病圃。6月中旬鉴定苗瘟抗性表型，9月中旬鉴定穗瘟抗性表型。

1.3 高效分子标记鉴定与基因型分析

利用课题组已开发的Pi9基因内的功能标记Ins2-1(引物序列为Forward：5′-AACTGTTTTAAACACTCGGGTGGATA-3′；Reverse：5′-CACGATGATAACTTGGGCTAGGGCG-3′)[10]，分析75-1-127与湘晚籼11号之间的多态性，并将其用于标记辅助选择育种实践中基因型的鉴定。抽穗前取水稻叶片约0.2 g于2.0 mL 灭菌离心管中，加入液氮研磨成粉末状，采用CATB法[11]提取总DNA；利用标记引物对各样品DNA进行PCR扩增；扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后分析标记基因型。10 μL PCR反应体系组成：DNA模板1.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸3 min；16 ℃保存。

1.4 回交自交育种群体构建

用湘晚籼11号作母本，75-1-127作父本，杂交获得F1代；用湘晚籼11号作轮回亲本，在长沙和三亚两地连续回交直至获得BC6F1代，自交两代获得BC6F3群体。回交群体构建具体方法：自BC1F1代起，每世代田间种植约60株，取单株叶片做标记基因型分析，选农艺性状与受体亲本接近的阳性单株回交，混合收种，获得下一世代。

2 结果与分析

2.1 供试水稻材料的稻瘟病抗性表现及抗菌谱

根据室内接种结果(表1)，75-1-127除了对湘2007A-7、ROR1这2份菌株感病外，其余均为抗病，抗性频率为91.7%；湘晚籼11号对24份稻瘟菌菌株中的7份表现为抗病，其余17份均为感病，抗性频率为29.2%；感病对照CO39对所有菌株均表现感病，抗性频率为0。由田间病圃抗性鉴定结果(图1)可以看出：受体亲本湘晚籼11号高感苗瘟和穗瘟；而75-1-127高抗苗瘟和穗瘟。湘晚籼11号抗菌谱窄、抗性水平低，其稻瘟病抗性急需改良；75-1-127抗菌谱广、抗性水平高，Pi9基因具有很好的育种价值。

表1 供试材料对24份稻瘟菌菌株的抗谱比较

图1 供试水稻材料田间病圃稻瘟病抗性表型

2.2 分子标记Ins2-1在双亲间多态性分析

双亲间多态性分析结果表明，Ins2-1是一个显性DNA标记，利用该标记引物可从75-1-127基因组中扩增出1条532 bp的清晰条带，而在湘晚籼11号基因组中无扩增产物(图2A)。并且该标记PCR产物可以用琼脂糖凝胶电泳检测分析，操作简单快速且成本较低。

2.3 湘晚籼11号改良抗病株系的选育

利用Ins2-1标记，从湘晚籼11号×75-1-127的BC1F1代起，开展分子标记辅助选择育种实践，于2016年获得BC6F1群体，2018年筛选出11个BC6F3株系，2019年经标记基因型分析和田间病圃稻瘟病抗性鉴定，遴选出9个高抗稻瘟病的改良株系湘晚籼11号-Pi9(图2)，为进一步培育优异抗病优质水稻新品种奠定了基础。

图2 抗病改良株系湘晚籼11 号-Pi9的鉴定

3 讨论

水稻稻瘟病抗性属于典型的质量—数量性状，抗性表型既受遗传(基因)控制，又受病原菌、温度、湿度、光照等环境因素影响，因此传统育种的表型选择往往不准确、效率低。分子标记辅助选择育种是对标记基因型的鉴定和选择，不受环境因素影响，相对于传统育种更准确高效，现已被广泛应用于作物遗传改良，尤其是稻瘟病抗性育种。本研究鉴定出的显性标记Ins2-1，可以在供体亲本75-1-127与受体亲本湘晚籼11号间产生明显而稳定的多态性，选择效率高，其扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳检测，成本低、效率高，具有较好的应用前景。广谱持久抗稻瘟病基因Pi9被成功克隆后，已被广泛应用于水稻育种实践。如廖花等[12]利用Pi9基因序列开发出共显性标记SPL-1，通过分子标记辅助选择，将Pi9基因导入籼稻恢复系R747 中，培育出了与受体亲本遗传背景高度相似的高抗稻瘟病新品系R747-Pi9，杂交种的稻瘟病抗性也同时改良；李永聪等[13]通过显性标记Ins1-1的辅助选择，成功改良了籼稻恢复系R389及其杂交种的稻瘟病抗性；邹俊锋等[14]利用共显性标记Ins2-3改良了籼稻恢复系E32及其杂交种的稻瘟病抗性；殷得所等[15]通过Pi9基因紧密连锁的共显性STS标记的辅助选择育种，成功改良了扬稻6号、R6547及其杂交种的稻瘟病抗性。

本研究获得的9个含Pi9基因的湘晚籼11号改良抗病系，将用于进一步的农艺、产量、米质等性状分析，以及不同生态区稻瘟病抗性鉴定，可望最终培育出高产优质抗瘟水稻新品种。