白色念珠菌生物膜与Toll样受体通路的免疫关系

赵冬梅，王 琨，冯奇刚，张海云

(1.牡丹江林业中心医院检验科，黑龙江 牡丹江 157011；2.南通市第六人民医院检验科，江苏 南通 226000)

白色念珠菌是引起血流感染最常见的致病菌之一，其致死率不断升高[1-2]。随着导管插管、人工植入装置的不断应用，机体在感染白色念珠菌以后菌株容易粘附在表面形成生物膜[3-5]，对各种环境刺激，如过氧化物、PH改变的敏感性降低[6-8]，耐药性将上升10～1000倍[9-10]。通常情况下，在人体感染白色念珠菌之后，表达于树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等固有免疫细胞的模式识别受体—Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)，通过识别不同致病菌的相关分子模式(pathogen associatedmolecμLarpatterns，PAMPs)激活固有免疫细胞及特异性免疫反应，在感染早期发挥作用而将其杀死，但生物膜形成以后这些成分被包裹而发生免疫逃逸[11-12]。目前，临床上对于产膜白色念珠菌引起的感染缺乏有效的治疗措施。本文分析产膜白色念珠菌感染的患者机体Toll样受体通路的变化，探讨产膜白色念珠菌在患者体内的免疫逃逸机制，为临床治疗白色念珠菌所致感染性疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集2017年1月至2018年12月间从牡丹江林业中心医院住院血流感染患者(60例)标本中分离的白色念珠菌，根据白色念珠菌是否产生生物膜将相应病例分成产膜组和非产膜组，每组30例；另纳入30例健康人为健康对照组。产膜组中男18例，女12例，年龄20～80岁，平均年龄(55.25±6.41)岁。非产膜组中男16例，女14例；年龄25～81岁，平均年龄(58.37±7.63)岁。健康对照组中男17例，女13例，平均年龄(56.84±7.49)岁。纳入标准：(1)年龄18～80岁，资料完整者；(2)在血液培养中分离出白色念珠菌的患者(不包括健康对照组)(3)意识清晰者，生命体征平稳者。排除标准：(1)在血液培养中分离出其他病原菌者；(2)三天内服用抗真菌药物者；(3)合并心肝肺等脏器功能衰竭者。三组研究对象性别比例、年龄等资料无显著差异(P>0.05)。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者及家属同意此次研究并签署相关知情同意书。

1.2 实验试剂与仪器结晶紫染料、RPMI 1640培养基、小牛血清(FBS)、RIzol(Invitrogen公司)、YPD液体培养基。RNA反转录试剂盒、ELISA试剂盒(上海齐一生物科技有限公司)、血清总蛋白提取试剂盒(普利莱基因技术有限公司)、基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。荧光倒置显微镜、荧光定量PCR仪(Iqtm5，QLYMPUS)、酶标仪(680，Bio-Rad)、全自动血培养仪(美国BD公司)、二氧化碳培养箱、离心机等。

1.3 血液标本采集及白色念珠菌的分离分别采集产膜组、非产膜组与健康对照组外周静脉血5mL保存于EDTA抗凝管中，4℃冷藏备用。以白色念珠菌10231作为标准菌株(温州康泰生物)。当血流感染患者体温超过38℃时，无菌操作采集其静脉血10 mL注入血培养瓶中，于全自动血培养仪中培养。报阳后利用珠海迪尔公司全自动微生物分析仪(DL96Ⅱ)将微生物鉴定到“种”水平，分纯备用。

1.4 白色念珠菌生物膜体外模型的构建及分析将1.3中分离出的白色念珠菌接种于血培养皿，置于37℃二氧化碳培养箱培养24h，后用长棉签沾取单个菌落，混合在RPMI 1640培养基中，调整菌浓度为1.0×106/mL。取100μL菌悬液加到96孔细胞培养板中，置二氧化碳培养箱中培养72h，经PBS冲洗3遍，戊二醛固定，最后加入结晶紫染液，30 min后冲洗，酶标仪检测吸光度。评价标准：A570>0.25为产膜菌；A570<0.25为非产膜菌[1-2]。加入荧光染料FITC-conA后，在荧光显微镜下观察不同产膜能力的菌株形态。

1.5 RT-PCR检测各组外周血单个核细胞中TLR2、TLR4、Myd88基因的表达量采用Ficoll密度梯度离心法直接收集外周血单个核细胞，提取总RNA，qRT-PCR测定基因TLR2、TLR4、MyD88 mRNA表达水平(引物序列见表1)。以β-actin为内参基因，采用2-△△Ct相对定量计算方法分析目的基因表达量的变化。

表1 引物序列

1.6 Western Blot检测各组外周血单个核细胞中Myd88蛋白的含量按照1.5的方法收集单个核细胞，参照说明书配置总蛋白溶液，BCA法测定蛋白质浓度。经电泳、转膜、封闭和孵育后，用化学发光剂显影，获取图像，Image J 软件处理系统分析Myd88蛋白及β-actin管家基因的表达水平。

1.7 ELISA测定各组细胞因子的分泌情况将研究对象外周血液标本，离心取上层血浆，采用ELISA方法对各组血浆中细胞因子IL-1β、TNF、IFN-γ、IL-4的表达量进行测定(具体测定方法参照试剂盒说明)。

1.8 统计学方法采用SPSS 23.0统计学软件进行分析，计量数据资料采用“均数±标准差”表示，组间比较则采用单因素方差分析，进一步两两比较行LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察FITC-conA染色后的菌株形态荧光显微镜观察FITC-conA染色后的菌株，发现产膜菌呈菌丝状相互交错密集排列，而非产膜菌大部分以酵母样黏附于培养板底部，见图1。

2.2 各组外周血单个核细胞中TLR2mRNA、TLR4mRNA、Myd88mRNA相对表达量的比较患者感染白色念珠菌后，机体对产膜菌与非产膜菌的免疫应答能力不同。以健康对照组为基线并设值为1，产膜组外周血单个核细胞中TLR2mRNA、TLR4mRNA、Myd88mRNA的相对表达量相较健康对照组低，而非产膜组相较健康对照组高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 各组外周血单个核细胞中Myd88蛋白含量的比较产膜组Myd88蛋白的含量较健康对照组显著降低(P=0.002)，非产膜组较健康对照组显著升高(P=0.002)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 各组外周血单个核细胞中MyD88蛋白的含量

2.4 各组血浆中细胞因子分泌情况的比较与健康对照组相比，产膜组患者血浆中IL-1β、TNF、IFN-γ浓度明显降低(P<0.05)，非产膜组上述指标浓度明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。在IL-4因子浓度变化方面，产膜组与健康对照组相比明显升高(P<0.05)，非产膜组与健康对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 ELISA测定各组细胞因子的浓度

3 讨论

有研究表明白色念珠菌生物膜是由大量菌丝相细胞、少量酵母相细胞以及由菌体分泌的基质共同组成的复杂结构[7-8]。因此，本实验将从血流感染患者中分离出的菌株分为产膜组和非产膜组，利用荧光显微镜观察其形态，发现产膜菌多呈菌丝状相互交错密集排列，而非产膜菌大部分以酵母样黏附于培养板底部，说明酵母相可能是白色念珠菌非生物膜状态的主要构成部分，菌丝相可能是白色念珠菌生物膜态的主要构成部分。菌丝态可维持成熟生物膜的结构的完整性和维持多层体系，具有抗吞噬作用，适应性和毒力更强，被认为更有利于逃逸宿主防御[12-13]。

在机体感染白色念珠菌时，模式识别受体TLR2和TLR4识别白色念珠菌表面的糖磷脂甘露聚糖，通过衔接蛋白Myd88，依靠Myd88依赖性途径和Myd88非依赖性途径来激活NF-κB和丝裂原蛋白激酶(mitogen-zctivatedprotein kinase，MAPK)级联反应通路，激活NF-κB信号传导通路，促进IFN-γ、IL-1、TNF-a等炎症因子的表达[14-15]，诱导CD4+T细胞向Th1型细胞分化，介导细胞免疫应答[16-17]。Myd88是所有TLR家族通路中的必须分子，被称为“万能衔接蛋白”[18-19]。有研究显示，TLR4激活后，胞内衔接蛋白Myd88表达量增加；采用TLR4抗体阻断后，Myd88表达量减少[20]，TLR2基因敲除抑制小鼠Myd88的高表达[21]，Myd88基因敲除后，小鼠的TNF-α和IL-1β分泌水平降低[22]。所以TLR2mRNA、TLR4mRNA、Myd88mRNA的低表达，直接限制TLR/Myd88/NF-κB信号通路传导，减少促炎性细胞因子的释放。至于Myd88的缺失是否能反向降低TLRs表达，还需要有研究数据来证实。

本文实验数据显示，单核—巨噬系统在吞噬杀灭非产膜菌和产膜菌的过程中，TLRs mRNA、Myd88mRNA和细胞因子的表达量有显著差异，产膜组TLR2 mRNA、TLR4 mRNA、Myd88 mRNA/蛋白和细胞因子IL-1、IFN-γ及TNF-α的表达量明显低于健康对照组，而非产膜组表达量高于健康对照组，表示产膜菌TLR/Myd88/NF-κB信号通路受阻，促炎性细胞因子释放减少，Th1型免疫应答减弱；另外细胞因子IL-4的表达量也不同，产膜组IL-4的表达量明显高于健康对照组，启动辅助性T细胞由Th0分化为Th2，触发Th2型免疫应答，促进B淋巴细胞发育和介导体液免疫[23-24]。体液免疫对巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬和杀伤病原体的能力有一定的抑制作用[23-24]。

综上所述，白色念珠菌生物膜可能通过下调TLR2的表达、干扰TLR4活化，抑制关键衔接蛋白Myd88的表达，使TLR/Myd88/NF-κB信号通路传递受限，无法诱导产生IFN-γ、TNF-α等促炎性细胞因子，使机体免疫应答朝着Th2型体液免疫反应发展，这可能是白色念珠菌逃逸机体免疫效应的一种方式，另一方面，也可能是机体调控白色念珠菌感染所致的炎症反应的重要机制。目前已经有研究表明，Ndt80是白色念珠菌形态转换中转录基因激活所必需，转录因子Tecl纯合缺失突变体使菌丝发育受阻[5,25-26]。下一步可以此为靶点研究药物针对基因的靶向治疗。随着分子免疫学和分子生物学技术的发展，基因工程抗体、分子疫苗、免疫佐剂、细胞因子和给予免疫激活等免疫技术的应用，治疗产膜白色念珠菌感染的难题一定会被攻克。