新鲜周期不同精子来源对子代先天性心脏缺陷风险队列研究的meta分析

刘巧媛

【摘要】 目的  评价辅助生殖技术（ART）对子代先天性心脏缺陷（CHD）发生的影响。 方法  计算机检索Cochrane Library、PubMed、EMbase、中国生物医学文献数据库、中国知网、维普和万方，检索时间从建库至2017年12月，并辅助其他检索方式，纳入开展新鲜周期下体外受精（IVF）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）和卵细胞浆内单精子注射（ICSI）助孕妊娠后子代先天性心脏缺陷（CHD）状况比较的队列研究，进行方法学的质量评估，使用RevMan 5.3进行Meta分析，并根据异质性进行敏感性分析和发表偏倚风险评估。 结果  共纳入7个高质量队列研究，分别来自法国、丹麦、中国、瑞典和挪威，出生儿共61997例。Meta分析结果显示：（1）新鲜移植周期ICSI组子代CHD发生率显著高于IVF组，OR=2.07[95%CI（1.28，3.37）] （P<0.05）。（2） 新鲜周期下附睾睾丸来源精子组对比ICSI组子代CHD发生率比较无显著性差异，OR=0.73[95%CI（0.36，1.45）]（P>0.05）。（3）新鲜周期睾丸来源精子组相比睾丸附睾来源精子组子代CHD发生率比较无显著性差异，OR=0.85[95%CI（0.2，3.71）]（P>0.05） 。 结论 新鲜周期中ICSI助孕子代CHD的发生率明显高于IVF助孕，新鲜周期下附睾睾丸来源精子组对比ICSI组没有增加先心病风险，睾丸来源精子相比睾丸附睾来源精子不增加先心病风险。提示不同来源的精子可能不是造成新鲜周期下ICSI组对比IVF组子代先天性心脏病风险较高的原因，但尚需更进一步的研究加以分析探讨。

【关键词】卵细胞浆内单精子注射（ICSI）;睾丸穿刺取精术（TESA）;附睾穿刺取精术（PESA）;先天性心脏缺陷（CHD）;队列研究;Meta

自1978年7月25日首例试管婴儿在英国诞生后，辅助生殖技术（ART）为越来越多的不孕不育患者解决了生育问题，全世界已有超过540万儿童在ART后出生。然而其安全性仍存在争议，其出生子代的出生缺陷问题引起越来越多人关注。先天性心脏缺陷（CHD）是最常见的出生缺陷，我国CHD的发生率高达14.2‰，且呈逐年上升趋势。有Meta分析研究表明ART子代CHD风险高于自然受孕的子代[1]。但是缺少针对不同ART对CHD影响的系统Meta分析。本研究采用Meta分析的方法比较新鲜周期下ICSI和IVF对子代CHD的影响，探讨其中不同精子来源对子代CHD的影响，为进一步认识ART的子代安全性和促进优生优育提供一定参考。

资料与方法

一、检索策略

通过计算机检索Cochrane Library、PubMed、Medline、EMbase等外文数据库以及维普（VIP）、中国知网（CNKI）、万方等国内数据库，检索时间从建库至2017年12月，并通过人工阅读检索参考文献以避免文献漏检。发表研究的语言限制为中文和英文。英文检索式以PubMed为例：#1：MeSH“assisted reproductive technology”[Title/Abstract];#2：MeSH“congenital malformations”[Title/Abstract];#3：MeSH“cohort studies”，结果：#1 And #2 And #3。所有检索采用主题词[MEDLINE （MeSH），EMbase （EMTREE）]与自由词相结合的方式，所有检索策略通过多次预检索后确定。检索对象限制为人类，文献类型限于队列研究（cohort studies）或病例对照（case-control studies）研究。

二、文献纳入及排除标准

納入所有ART与子代CHD关系的队列研究，语种限于中英文，未限人群。纳入标准如下：（1）采用队列研究设计;（2）暴露因素为接受IVF或ICSI治疗并新鲜周期移植;（3）研究对象为接受IVF或ICSI治疗并新鲜周期移植后出生的婴儿;（4）观察终点为出生时所有类型CHD。

文献排除标准：（1）同人群重复研究;（2）CHD患者接受ART治疗的研究;（3）ART与其他出生缺陷的相关研究;（4）重要资料报告不全且联系作者未回复者。

三、研究质量评价

采用Newcastle-Ottawa scale （NOS）量表对入选文献进行评分，评价内容包括：（1）暴露队列的代表性：①能够很真实地代表社区人群的平均或基本可以代表社区人群的平均 （1分）;②选取特殊人群或没有说明队列的来源（0分）。（2）非暴露队列的选择：①来自暴露队列的同一社区（1分）;②与暴露队列的来源不同或没有说明非暴露队列的来源（0分）。（3）暴露的确定：①可靠的记录或结构化调查（1分）;②书面的自我报告或无描述（0分）。（4）研究开始前没有研究对象发生结局事件（1分）。（5）可比性：①研究控制了最重要的因素（1分）;②控制了其他重要的混杂因素（1分）。（6）结局事件的评估：①独立的、盲法的评估或鉴定或联动数据（1分）;②自我报告或无描述（0分）。（7）为观察到结局发生，随访充分（1分）。（8）随访的完整性：全部随访或少数失访或对失访进行了描述（1分）。

四、资料提取

由3位研究者按照纳入与排除标准独立筛选文献，采用事先设计的资料提取表提取信息，包括研究项目时间、地点，纳入者的一般特征，接受ART类型，结局类型与随访时间，并逐一交叉核对。如存在分歧，则通过讨论解决;如研究报告的资料不全，则进一步与该研究作者联系获取，若最终未获得相关数据，则剔除该项研究。

五、数据分析

采用Cochrane协作网提供的RevMan5.3统计软件对7篇最终纳入研究的文献进行Meta 分析，并根据周期类型及CHD类型进行亚组分析。首先采用Cochrane Q检验及I2检验对研究间异质性进行检验，若P≥0.1说明研究间同质性较好，反之则具有异质性;根据I2值进一步按照25%、50%、75%将异质性划分为低、中、高3个等级。若研究间同质性较好，则采用固定效应模型进行合并，反之则选择随机效应模型，并对其异质性来源进行分析，P<0.05认为差异有统计学意义。根据可能出现的异质性因素进行亚组分析，并采用敏感性分析来分析检验结果的稳定性。同时采用漏斗图判断发表偏倚。

结  果

一、文献检索结果

初检相关文献1 039篇，其中英文942篇，中文97篇。经过剔除重复文献并阅读文题和摘要后剔除明显不符合纳入标准的805篇，然后通过阅读全文，进一步排除不符合纳入标准及无法提取数据的研究227篇，最终纳入7篇队列研究[2-8]进行Meta分析，出生儿共61997例。其中4篇[3， 6-8]对不同来源的精子做了细分。文献筛选流程见图1。

二、纳入研究的基本特征

纳入研究包括7篇研究[2-8]不同ART与CHD关系的英文文献，其中4篇[3， 6-8]研究了不同来源精子与CHD的关系。纳入的7篇研究均为队列研究，其中2篇[5， 7]为前瞻性队列研究，5篇为回顾性队列研究。各研究特征见表1。

三、纳入研究的方法学质量评价

由3位研究员独立进行文献检索并提取资料。筛选研究的方法学质量评价采用 Newcastle-Ottawa scale（NOS）量表[5，7]进行评估，具体包括研究人群选择、可比性、结果评价3个部分共8个条目。采用星级系统的半量化原则，满分为9颗星（9分），7篇研究质量评分≥8分，均为高质量队列研究。混杂因素设定为女方年龄、病因、不孕年限、多胎妊娠等。各研究质量评价结果见表2。

四、Meta分析結果

1. 新鲜周期下IVF和ICSI对子代CHD发生的影响：对其中3项包括新鲜周期下IVF和ICSI对CHD风险的影响队列研究[2， 4， 5]进行异质性检验I=0%且P=0.99，表明纳入的3项研究无异质性，采用固定效应模型。Meta分析结果如图3，OR=2.07[95%CI（1.28，3.37）]且Z=2.35（P=0.003），提示新鲜周期时ICSI组比IVF组子代有更高的CHD发生率，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.  新鲜周期不同精子来源对先天性心脏病风险的影响

通过对2篇研究[3， 7]新鲜周期下附睾睾丸来源精子组对比ICSI组对子代先天性心脏病影响的队列研究进行异质性检验I=0且P=0.35表明无异质性，所以应用固定效应模型，OR值为0.73（0.36，1.45）且Z=0.91（P=0.36）说明两组之间无统计学差异，说明新鲜周期下附睾睾丸来源精子组对比ICSI组没有增加先心病风险。

通过对2篇[6， 8]新鲜周期睾丸来源精子组相比睾丸附睾来源精子组对先天性心脏病影响的高质量队列研究进行异质性分析I=0且P=0.76（P>0.1）提示无异质性，用固定效应模型，OR=0.85（0.2，3.71）且Z=0.21（P=0.83）提示两组之间差异无统计学意义，睾丸来源精子相比睾丸附睾来源精子不增加先心病风险。

五、发表偏倚分析

采用RevMan5.2软件绘制7项研究的漏斗图。图形显示，左右对称且呈倒漏斗形，提示不存在发表偏倚（图5）。

2.5 发表偏倚

讨  论

本Meta分析纳入了7篇[2-8]关于不同ART对CHD发生风险的队列研究，其中有4篇[3， 6-8]涉及不同精子来源的队列研究，分别来自法国、丹麦、中国、瑞典和挪威，出生儿共61997例。我们通过对新鲜周期下ICSI与IVF的队列研究进行分析，发现新鲜周期中ICSI组比IVF组子代CHD发生风险显著提高OR=2.07[95%CI（1.28，3.37）]（P<0.05）。相比IVF，ICSI主要适用于男性因素不育。男性不育往往伴有较高的精子染色体异常率。畸形精子症的精子有较高的DNA断裂率。少弱精伴有基因异常引起胚胎致死性。少畸形精子伴有染色质及DNA异常及高水平甲基化。严重男性因素可导致胚胎染色体异常几率升高。且有文献报道男性遗传缺陷的传递无法被囊胚培养阻断[9]。相比对照组梗阻性与非梗阻性无精子症患者胚胎PGS结果显示非整倍体率均大大增高。精子染色体异常与DNA断裂与复发性流产相关。DNA断裂与胚胎质量显著相关。同时男性不育不但与染色体的“量”异常相关，还与染色体“质”异常相关。由于男性不孕患者伴有较高的Y染色体微缺失， ICSI治疗后的男性后代出现Y染色体微缺失率相对较高。

然而我们对新鲜周期下不同精子来源的队列研究进行了进一步的亚组分析，发现新鲜周期下下附睾睾丸来源精子组对比ICSI组没有增加先心病风险（P>0.05），且睾丸来源精子相比睾丸附睾来源精子也不增加先心病风险（P>0.05），提示不同来源的精子可能不是造成新鲜周期下ICSI组对比IVF组子代先天性心脏病风险较高的原因。这与早前前瞻性研究中相似[10]，即不同来源的精子的新生儿出生缺陷率没有差异。同样许多研究[3， 6， 11-13]表明，无论睾丸或附睾来源的精子ICSI后其结局并没有明显的差异，且与正常射出精子ICSI相比的妊娠率等结局也无显著差异。在ICSI周期中男性因素不影响高质量囊胚形成率与妊娠率。

相比射精对照组，睾丸来源精子在生成的胚胎的两组在受精后胚胎发育早期有差异，但从5细胞后差异不明显且活产率没有统计学差异。2016年的meta分析表明睾丸精子组和射精组两组间的受精率无显著差异[14]。睾丸精子组与射精组流产率无显著差异[15]。另一篇2018年的meta分析显示优胚率， 着床率和妊娠率方面，睾丸精子ICSI优于射精子ICSI[16]。同样，另一篇在对精子DNA片段化水平高的男性进行ICSI的系统回顾中，相对射精组，睾丸组流产率低且带抱婴率更高[17]。这可能是由于氧化应激作用，睾丸组的DNA断裂率比射精组要低得多。而低DNA断裂率证明与与高抱婴率与低流产率相关。有研究建议DNA断裂和少弱精症及反复IVF失败的病人采取TESA更佳[18]。但是DNA断裂是否与先天性畸形相关尚不清楚。

我们推测新鲜周期下ICSI增加先天性心脏病风险可能与受精方式本身相关。并且与IVF相比，ICSI绕过了卵母细胞对精子的自然选择的屏障，可能会使质量差的精子受精，将某种基因缺陷和高遗传风险的基因传给下一代，从而增加了后代出生缺陷的风险。ICSI的过程中体外培养会使精子活动力的减低并伴有DNA的断裂和基因印记的改变。有研究[19] 发现相比IVF组，ICSI组的胚胎染色体畸变率高，且与精子培养环境和精子孵育时间密切相关。与常规的IVF过程相比，单精子胞浆注射技术增加了对于卵母细胞内的显微有创操作，因此ICSI操作过程中也可能存在对卵母细胞的结构的机械性损伤，导致受精异常、染色体非整倍性和胚胎发育异常。而这些非整倍体胚胎可发育到囊胚。在注射过程中，顶体膜和酶经常与精子一起注射到卵母细胞中，然而，在传统的受精过程中，它们从不穿透卵母细胞的质膜，大量顶体酶干扰受精的进程。因此ICSI被认为可增加染色体数目异常发生的概率。ICSI治疗后的男性后代出现Y染色体缺失及染色体核型异常发生率相对较高，包括22q11.2缺失，18号染色体异常等。

而染色体改变和基因异常等遗传因素是CHD的危险因素。22q11.2微缺失被认为与严重主动脉肺动脉侧支动脉、PDA、肺动脉闭锁和VSD等主要CHD发病有关。GATA4等基因的突变、拷贝数变异、多态性和甲基化常都可引起心脏畸形，其中心臟特异转录因子基因TBX5、GATA4等异常可导致如ASD、VSD、PDA、TOF、心内膜垫缺损及右心室发育不良等许多遗传性和单发CHD。多种miRNAs、cirRNAs和lncRNAs的表达调控异常也逐渐被发现与CHD相关。ICSI有创的受精方式和配子较高的低质量率所带来的胚胎染色体及基因异常率增加，可能与ICSI组子代较高的CHD发生率有关。

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