2018–2019年安徽地区H9N2亚型禽流感病毒进化分析

张 锐，盛 豪，倪温碧，卞希一，颜 焰，廖 敏，周继勇

（浙江大学 农业农村部动物病毒学重点实验室，杭州310058）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正黏病毒科中的流感病毒属，为单股负链RNA病毒。H9N2亚型AIV是中国大陆家禽中感染最普遍的AIV，经过多年的遗传进化后，病毒的致病性和传播性呈逐年上升的趋势，其在养鸡场中普遍存在，极大危害着中国养禽业的发展[1]。H9N2亚型AIV可跨越物种屏障直接感染人类[2]，还为H7N9、H10N8、H5N6等提供内部基因的供体[3-5]，这意味着H9N2病毒具有重大的公共卫生威胁。本研究在对2018-2019年安徽省养殖场AIV持续监测的基础上，分离获得5株H9N2亚型AIV，并对其病毒基因序列及关键氨基酸位点进行分析，构建系统进化树。

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要试剂 SPF鸡胚购自宁波纯派农业科技有限公司；rTaq酶、pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；反转录试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；总RNA提取试剂、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase等购自南京诺唯赞生物科技有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞由农业农村部动物病毒学重点实验室保存。

1.2 样品来源与病毒检测 检测样品为2018年5月至2019年11月定期采集自安徽某养鸡场疫苗免疫鸡群的咽肛拭子，共2763份。拭子样品经灭菌PBS处理后，离心取上清液提取RNA，然后采用RT-PCR方法对样品进行AIV的检测及H9亚型鉴定。检测M基因上游引物：5'-CGTAGACGCTTTGTCCAAAAT GCC-3'；检测M基因下游引物：5'-AAGACGATCA AGAATCCACAATA-3'；H9分型的上游引物：5'-CAGAACAAGAAGGCAGCAA-3'；H9分型的下游引物：5'-AATGTGATGACCARTGCATGG-3'。

1.3 病毒的分离鉴定 将核酸检测为阳性的样品离心取上清液接种9～11日龄的SPF鸡胚，置于37℃孵化箱中观察，弃去24 h内死亡鸡胚，72 h后收集鸡胚尿囊液提取RNA，用RT-PCR扩增获得目的片段，并通过对目的片段序列测定对分离病毒进行定型。

1.4 病毒基因组测序与序列分析 提取1.3收获的病毒尿囊液RNA，使用UNIT12通用引物（12A：5'-AGCAAAAGCAGG-3'），将其反转录成cDNA，根据参考文献[6]设计全基因组测序引物。纯化的目的片段与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后挑取阳性克隆送测序。应用MEGA6.0软件进行序列拼接后对各基因节段的序列进行同源性及关键位点的分析，并绘制各基因节段的系统进化树。

2 结果

2.1 样品的检测与病毒分离鉴定 本实验室自2018年5月至2019年11月共收集安徽省某养殖场咽肛拭子样品2763份。采用RT-PCR的方法进行AIV的检测，检测到36份样品AIV阳性，阳性率为1.30%。采用鸡胚接种分离法获得5株H9N2亚型AIV，分别命名为A/Chicken/Xuancheng/01/2018（简称为CK/XC/01/18）、A/Chicken/Xuancheng/01/2019（简称为CK/XC/01/19）、A/Chicken/Xuancheng/02/2019（简称为CK/XC/02/19）、A/Chicken/Xuancheng/03/2019（简称为CK/XC/03/19）和A/Chicken/Xuancheng/05/2019（简称为CK/XC/05/19）。

2.2 病毒基因组序列分析与关键氨基酸位点分析

2.2.1 HA基因的序列及关键位点氨基酸分析 5株H9N2分离毒株HA的ORF全长均为1683 bp，编码560个氨基酸。核苷酸同源性为94.47%～99.76%，氨基酸序列同源性为96.25%～100%。HA的序列分析显示，5株H9N2分离株的HA裂解位点均为PSRSSRGLF，符合低致病性AIV的特征。HA的受体结合位点分析如表1所示，HA基因受体结合位点左侧壁和右侧壁序列与Y280、F98均有差异，其中234位氨基酸突变为L，具有结合人类受体的能力。5株H9N2分离毒株的HA蛋白381位氨基酸均为K，该位点被认为是有利于H9N2病毒气溶胶传播特性的关键位点[7]。HA蛋白的N166D突变会导致鸡的抗体水平降低，这可能是导致H9N2疫苗免疫失败的原因[8]。而5株H9N2分离株中，CK/XC/01/18与CX/XC/01/19在此位点均为D，而其他3株H9N2病毒仍为N。HA蛋白的糖基化位点对病毒有着重要影响，如果缺失则会导致病毒与鸡红细胞的结合能力下降[9]。本次分离的5株H9N2分离毒株的HA蛋白存在7个潜在的糖基化位点，分别在29、141、298、305、313、492、551位氨基酸上，与参考毒株Y280、F98相比，5株H9N2分离株的HA蛋白缺少218位的潜在糖基化位点，但在313位均有潜在的糖基化位点，而该位点被认为是2013-2018年间H9N2病毒变异的新特征[10]。

表1 5株H9N2分离株HA基因受体结合位点分析Table 1 Analysis of receptor binding sites of HA gene of five H9N2 isolates

2.2.2 NA基因的序列及关键位点氨基酸分析 5株H9N2分离毒株NA的ORF全长为1401 bp，编码466个氨基酸。核苷酸同源性为96.15%～99.86%，氨基酸序列同源性为97.00%～99.79%，其均在茎部63～65位缺失了T、E、I 3个氨基酸，导致其第61位缺少糖基化位点。5株H9N2分离毒株均存在69、86、146、200、234、368位的潜在糖基化位点，然而CK/XC/02/19、CK/XC/03/19、CK/XC/05/19存在402位的潜在糖基化位点，表明NA蛋白的402位潜在糖基化位点存在一定的变化趋势。根据参考文献[11]对NA的关键氨基酸位点进行分析，详情见表2，CK/XC/01/18与CK/XC/01/19在活性中心的141位、143位氨基酸依次为E、K，在红细胞吸附位点的402位氨基酸为D，而CK/XC/02/19、CK/XC/03/19、CK/XC/05/19则对应依次为K、E、N，其余位点5株H9N2分离毒株均较为保守。

表 2 5株H9N2分离株NA基因的关键位点分析Table 2 Sequence analysis of key points of NA gene of five H9N2 isolates

2.2.3 内部基因的关键位点氨基酸分析 5株H9N2分离株PB2蛋白并未发生E627K、N701D的突变，但其中有3株H9N2病毒的PB2蛋白发生了E627V的变化，该突变能够显著增强病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性，并增强病毒对小鼠的致病力[12]。5株H9N2分离株的PB2蛋白存在R340K和A588V的2个氨基酸突变，该突变使H9N2病毒在豚鼠间的空气传播成为可能[13]。研究表明PB2蛋白的292V是一种新型的哺乳动物适应性标记，可促进H9N2病毒在哺乳动物宿主中的复制，并有可能促进病毒从禽类向人类的传播[14]。5株H9N2分离株具有此标记。5株H9N2分离株PA蛋白的第672位氨基酸为L，表明5株H9N2病毒具有气溶胶传播的能力。其356位氨基酸为R，有利于H9N2病毒对哺乳动物的适应性[15]。M2蛋白在31位氨基酸均为N，表明5株H9N2分离株对流感药物金刚烷胺产生耐药性。NP蛋白F253I突变可能导致病毒在小鼠中的致病性减弱和细胞向性改变[16]，5株H9N2分离株NP蛋白具有这种突变。

2.3 8个基因节段的遗传进化分析 利用Mega6.0软件对5株H9N2亚型AIV的8个基因片段分别构建系统进化树（图1）。结果显示，5株H9N2分离毒株HA、NA基因位于Y280-like分支，PB2、M基因位于G1-like分支，PB1、PA、NP、NS基因位于F/98-like分支，为3配体重组H9N2亚型AIV。

3 讨论

图1 5株分离毒株8个基因节段的进化树Fig.1 The phylogenetic tree based on 8 gene fragments of 5 isolates

本文通过对持续监测的一个安徽大型养殖场分离的5株H9N2亚型AIV的序列分析表明，新分离毒株的HA基因均处于Y280分支，裂解位点均为PSRSSRGLF，无多个连续的碱性氨基酸，但234位的氨基酸为L，具有结合人类受体的能力。2株H9N2分离毒株的HA蛋白出现N166D的突变，其会影响鸡的抗体水平，这可能是经过持续疫苗免疫后的养殖场中仍能分离到H9N2亚型AIV的原因之一。气溶胶传播是流感病毒有效的传播途径，5株H9N2分离毒株在HA蛋白的381K、PA蛋白的672L以及PB2蛋白的R340K和A588V的2个氨基酸突变，都对H9N2亚型AIV气溶胶传播的特性有重要的影响。研究报道高致病性H7N9病毒在雪貂或人类体内进行复制时会产生PB2蛋白E627K或者D701N的适应性突变[17]，而5株H9N2分离株无此突变，但其中有3株H9N2分离株的PB2蛋白发生了E627V的变化，并且5株H9N2分离株均存在PB2蛋白292V的哺乳动物适应性标记，这些哺乳动物适应性突变位点的变化应该引起我们的注意。

蛋白的糖基化修饰一直是人们关注的热点，分析中发现5株H9N2分离毒株的HA蛋白在218位缺少了潜在的糖基化位点，却在313位均存在潜在的糖基化位点，研究表明这种变化会影响H9N2病毒对鸡胚和鸡的感染力及病毒在组织中的复制能力，但却不影响病毒的气溶胶传播特性与抗原性[18]。5株H9N2分离株的NA蛋白在63～65位发生3个氨基酸的缺失，均导致61位氨基酸出现糖基化位点消失。然而相比于分离毒株CK/XC/01/18与CK/XC/01/19，分离毒株CK/XC/02/19、CK/XC/03/19和CK/XC/05/19在402位存在潜在糖基化位点，表明H9N2亚型AIV NA蛋白的402位潜在糖基化位点存在一定的变化趋势。

2010-2013年，基因型G57的H9N2亚型AIV在中国占据主导地位[19]，2013-2016年，以A/Chicken/Rizhao/249/2013病毒为代表的G57基因型仍是中国H9N2亚型AIV中的主要基因型[20]，蒋大秀[21]对于华东地区2016-2018年的H9N2亚型AIV的流行病学调查表明，H9N2亚型AIV的优势基因型为S基因型（通常等同于G57基因型），即HA基因、NA基因属于Y280-like，而来源于G1-like的PB2基因与M基因则重配到F/98-like病毒中。遗传进化分析显示，本研究分离的5株H9N2亚型AIV的8个基因片段在Y280-like、G1-like及F/98-like均有分布，符合当前H9N2亚型AIV的流行趋势。有趣的是，5株H9N2分离株彼此之间的氨基酸同源性很高，CK/XC/01/19与CK/XC/01/18相比，仅NA蛋白发生了N393D的变化，M2蛋白发生G89V的变化；CK/XC/05/2019与CK/XC/03/19相比，仅HA蛋白发生I139V、G181E、I535L的变化，NA蛋白发生E54D、Q136H、S245R的变化。目前，关于这些氨基酸的变化是否对病毒的传播与致病性存在影响，需要我们进一步的研究。但这暗示在疫苗免疫的过程中，病毒为了生存，自身会进行一定的变异，这一点需要我们重视。此外，根据我们对养殖场AIV的持续监测结果，在持续进行H9N2疫苗广泛接种的养殖场中仍能检测到H9N2亚型AIV的存在，这表明持续监测疫苗免疫鸡场H9N2亚型AIV的流行情况对于指导AIV的有效防控是至关重要的。