基于网络药理学考察八正散加减方治疗慢性前列腺炎的作用及可能机制

白鑫宇,杨 萍,刘 萍

(遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis, CP)是一种临床常见病，主要指前列腺组织受到异常刺激，引起以小腹和会阴部疼痛、尿道灼热、排尿异常、尿后滴白等为主要表现的一组临床症候群[1]，在中医学属“淋病”“癃闭”“尿浊”等疾病范畴，其发生多与患者外感湿热、饮食不节、情志失调、劳伤体虚等因素有关[2]，但机制研究尚不完善。西医治疗慢性前列腺炎虽有多种方法[3-4]，但整体疗效欠佳，长期疗效不确切。近年来中医药被广泛应用于慢性前列腺炎的辅助治疗中，其在提高尿流量、控制炎症反应及改善患者临床症状等方面具有独特的疗效[5-7]。

八正散出自中医经典著作《太平惠民和剂局方》，由萹蓄、车前子、瞿麦、滑石、甘草、栀子、木通及大黄八味药组成。方中木通、车前子、瞿麦、萹蓄、滑石为利水通淋之品，清利湿热[8-9]；伍以栀子，清泄三焦湿热[10]；大黄泄热降火[11]；炙甘草调和诸药，兼能清热、缓急止痛。全方有清热消炎、利水散结、泻腹通便的作用，广泛用于包括泌尿系统感染在内的多种疾病[12]，已有研究显示八正散可显著改善慢性前列腺炎患者临床症状和体征，药理作用上发挥利尿、消炎、抑菌作用[13-14]，但是相关研究尚少、具体的作用机制还不明确。在临床使用上，《中药亲试记》记载(张纯锡著)，可用白茅根替代滑石，在现代中医药研究中，也有使用白茅根替代滑石进行辨证施治的先例[15-16]。因此，本文使用白茅根代替滑石进行网络药理学分析。

中药复方治疗临床复杂疾病有独到之处，但因成分多、机制复杂，使其进一步开发利用受到限制。网络药理学基于系统生物学、分子生物学和药理学，联合在线数据库、软件等，挖掘药物与疾病交集基因并进行分析展示，可视化后的数据能更直接地阐释中药复方与疾病的关联性，全面探讨方剂治疗疾病的可能疗效及机制。

1 资料与方法

1.1 八正散加减方靶点预测 通过中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology, TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)筛选八正散加减方各药味成份及靶点蛋白。将萹蓄、车前子、瞿麦、白茅根、甘草、栀子、木通及大黄分别输入检索框，获取Ingredients，选取口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%，药物相似度(drug like, DL)≥ 0.18且Caco-2 ≥ 0.4的化合物再找出相应的靶点基因[17]。

1.2 慢性前列腺炎靶点预测 登录GeneCards(https://www.gene-cards.org/)及OMIN(https://omim.org/)在线数据库输入“Chronic prostatitis”，获取靶点基因[18-19]。

1.3 药物靶点与疾病靶点标准化及蛋白相互作用网络构建 利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库，将以上获得的八正散加减方靶标转换为标准基因名称。分别将八正散加减方的靶点基因名和慢性前列腺炎靶点基因名导入Venn(http://bioinformaTics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线数据库获取两者交集基因。在STRING(https://string-db.org/)在线数据库中[20]，选择“Multiple proteins”并输入交集基因，设置最低相互作用得分为0.90，隐藏断开连接的点，得到蛋白相互作用网络并导出tsv文件。通过barplot统计得出核心基因；将tsv文件导入Cytoscape 3.2.1(http://www.cy-toscape.org/)软件，按照类别调整节点的颜色和字体大小后得到可视化结果。过程中所涉及的物种选项均设置为“Homo Sapiens(Human)”。

1.4 基因本体论(GO)和KEGG通路富集分析 使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在线数据库[21]，设置P<0.05，进行GO和KEGG通路富集分析，然后使用R studio可视化，以反映八正散加减方治疗慢性前列腺炎可能的生物过程、分子功能、细胞组分和通路。结果以条形图或气泡图展示，P值越小，富集程度越高；count越大，则富集在上面的基因越多。

2 结果

2.1 八正散加减方活性成分及基因靶点名称 从TCMSP在线数据库检索白茅根、萹蓄、车前子、大黄、甘草、瞿麦、木通、栀子，按照OB≥30%，DL≥0.18及Caco-2≥0.4的筛选条件，筛选出符合条件的活性化合物87个，基因靶点79个。其中白茅根包含3个化合物40个基因，扁蓄包含1个化合物3个基因，车前子包含3个化合物10个基因，大黄包含4个化合物34个基因，甘草包含71个化合物57个基因，木通包含5个化合物44个基因，栀子包含7个化合物51个基因，八正散加减方基因靶点信息见表1，八正散加减方中活性化合物基本信息(见表2)。

表1 八正散加减方基因靶点信息

表2 八正散加减方活性化合物基本信息

2.2 慢性前列腺炎靶点筛选 通过GeneCards及OMIM数据库获取“Chronicprostatitis”靶点去重并查询基因名，最终得到7397个基因名。

2.3 八正散加减方和慢性前列腺炎交集基因预测并构建蛋白相互作用网络 分别将八正散加减方(79个靶基因)和慢性前列腺炎(7397个靶基因)的靶基因名输入Venn在线数据库检索框，得到两者交集基因共69个，如图1。将69个交集基因输入STRING在线数据库，按前述所说设置相应值后得到PPI网络如图2，图中线条表示相互作用，不同颜色的线条表示不同的相互作用类型。Barplot所展示数据为该基因在PPI网络中所连接基因数，越多则该基因在网络中的作用越关键，详见图3。经Cytoscape所得可视化图阐明了八正散加减方活性化合物和慢性前列腺炎疾病相关基因的相关网络(“成分-疾病-靶点”)(见图4)。

图1 八正散加减方和慢性前列腺炎Venn图

图4 八正散加减方和慢性前列腺炎“成分-疾病-靶点”网络

2.4 基因本体论(GO)富集分析结果 基因本体论(GO)富集分析结果认为，八正散加减方治疗慢性前列腺炎可能是通过影响核受体、类固醇激素受体、蛋白质异二聚体、单加氧酶、醇脱氢酶活性。通过结合、还原分子氧而作用于成对供体来调节氧化还原酶活性以及调控近端启动子序列特异性DNA结合、谷胱甘肽结合、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合、雌激素受体结合、泛素样蛋白连接酶结合、类固醇激素受体结合、RNA聚合酶II基础转录因子结合过程也可能是八正散加减方发挥作用的方式(见图5)。

图5 八正散加减方治疗慢性前列腺炎GO富集分析

2.5 KEGG富集分析结果 KEGG富集分析结果预测八正散加减方治疗慢性前列腺炎可能通过多靶点完成，其中得分较为靠前的通路有：(1)AGE-RAGE信号通路；(2)IL-17信号通路；(3)Th17信号通路(见图6～10)。

图6 八正散加减方治疗慢性前列腺炎KEGG富集

图7 AGE-RAGE信号通路

图8 IL-17信号通路

图9 Th17信号通路

图10 前列腺癌信号通路

3 讨论

慢性前列腺炎致病机制复杂且并不完全清楚，加之前列腺解剖结构特殊，给其治疗带来较大困难[22]。在中医辨证施治的一项证型调查中发现，其湿热下注证型比例高达74%(总病例数位304)。这与自古中医在治疗前炎上也多以清泄湿热，利水通淋为主的实践相吻合[23]。八正散为治疗热淋的常用方，具有清热除湿、利水通淋的功能，用于湿热淋证所致的尿频、尿急、溺时涩痛、淋沥不畅、尿色浑赤，甚则癃闭不通，小腹急满，口燥咽干，舌苔黄腻，脉滑数。如前所述，滑石在临床应用中具有诸多禁忌，本文通过去滑石，加白茅根的加减方进行网络药理学分析。方中木通苦寒，可泻火行水，为本方君药。《药性论》谓其有“疗五淋、利小便、除烦热”之效，《本草拾遗》谓“利大小便，令人屯、宽下气”，《食疗本草》谓其“煮饮之，通妇人血气，又除寒热不通之气，煮汁酿酒妙”，可知其有利尿通淋、泻火、通利血脉之功。白茅根凉血止血，清热利尿，同为本方君药。瞿麦破血通经、清热利水，萹蓄杀虫止痒、利尿通淋，车前子渗湿、利尿、通淋，为本方臣药。萹蓄味苦、性微寒，有利水通淋、驱虫疗痒之功，如《本草汇言》载：“萹蓄，利湿热，通利小便之药也”《滨南本草》亦言其有“利尿通淋之功，可痊五淋之白浊、热淋之涩痛，并可解瘀精之涩闭所致的水道之不通”。车前子味性甘微寒，《神农本草经》谓其有“止痛，利水道小便”之效，佐以栀子清利三焦湿热；大黄泻热通肠、逐瘀通经，荡涤邪热使之从大便而去。使药为甘草，可和药缓急。以上研究表明，中医药治疗本病时辨证施治，具有一定优势。八正散治疗慢性前列腺炎在临床已取得确切疗效，但机制研究尚不明确。全面、详细地阐明其作用机制有利于八正散的推广使用、促进慢性前列腺炎的研究进展和优化治疗方案。

首先通过数据库查询八正散加减方各味药可影响的基因数据，再通过疾病数据库查找疾病的基因集合，对二个基因集合取交集，发现有69个交集基因，提示可以通过对交集基因的分析考察八正散加减方作用的靶点，通过GO基因分析，发现八正散加减方治疗慢性前列腺炎可能是通过影响核受体、类固醇激素受体、神经递质受体活性协同完成八正散加减方活性成分在体内的调控作用。MAPK受体结合、泛素样蛋白连接酶结合、核内固醇激素受体结合过程也可能是八正散加减方活性成分发挥治疗作用的方式。以上预测结果为阐述八正散加减方治疗前列腺炎提供了一定依据，还需要通过大量的临床前及临床实验进行进一步确认。

通过KEGG进行分析，排除其他非相关性疾病，筛选出3个信号通路，分别为：(1)AGE-RAGE信号通路，预测认为八正散加减方可能是基于AGE/RAGE/JNK/NF-κB、Bcl-2/VEGF、SELE、VCAM、IL-6、CASP3等AGE-RAGE通路发挥治疗慢性前列腺炎作用，详见图7；(2)IL-17信号通路；(3)Th17信号通路。这两个通路均指向Th17分化途径。目前已有研究证实炎症途径参与八正散治疗前列腺炎的过程：严旭东等[8]通过临床研究表明，联用八正散加减方治疗尿路感染能有效降低患者TNF-α、IL-6、IL-8及降钙素原(PCT)，改善临床症状、减少复发、提高生活质量。本分析进一步提示抗炎免疫方向可能是研究八正散加减方作用机制新的突破口。

此外，我们还发现前列腺癌信号通路在KEGG分析中富集显著性P值小于0.001(P=1.62×10-7)，提示八正散加减方可能通过MAPK10/STAT3/RELA/CCND1/MAPK1/RB1/CASP9/BAX等基因，参与调控前列腺癌，这可能为进一步研究八正散加减方提供一定的指向性以及理论依据。

网络药理学证实八正散加减方治疗慢性前列腺炎具有多靶点、多通路的特点，分析得出的可能作用方式和机制在现有研究中暂未涉及，或可为八正散和慢性前列腺炎的深入研究提供思路。网络药理学有其优势，也有受限之处，即整个过程的相关数据来源于已有研究，研究充分的内容则为其所用，但被筛除的通路或靶点或许在疾病或药物治疗中发挥着重要作用，因此，结合网络药理学的分析结果进行目标通路的功能验证可以进一步为开发传统方剂奠定基础。

综上所述，通过网络药理学分析，八正散加减方治疗慢性前列腺炎具有多靶点、多通路的特点。机制分析具有一定的指向性，可以为深入开发八正散提供理论依据。