Fez家族锌指蛋白 1反义RNA 1在宫颈癌组织中表达及与患者临床特征及预后的相关性

黄丽，龚豪，张春莲，方彩云，黄润强

十堰市太和医院1妇科，2肾病内科，湖北 十堰442000

宫颈癌是发病率居全球第2位的女性恶性肿瘤，是女性恶性肿瘤病死的主要原因[1-3]。宫颈癌临床标准化治疗方案包括放疗、化疗及根治性切除术，术后患者预后差异较大，目前仍缺乏有效评估其预后的肿瘤标志物。随着现代基因芯片技术与基因测序技术的不断发展，越来越多的非编码RNA经研证实在人体疾病诊治中发挥着重要作用[4-5]。既往研究认为，长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是基因组RNA里面“转录噪声”，亦被证实能够于表观遗传、转录与完成转录后水平调控相应基因表达。研究表明，Fez家族锌指蛋白 1反义 RNA1（FEZF1 antisense RNA 1，FEZF1-AS1）在恶性肿瘤病灶发生及发展过程中发挥重要作用[6]。本研究拟探讨FEZF1-AS1在宫颈癌组织中的表达情况及其与患者临床病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年7月十堰市太和医院收治的宫颈癌患者。纳入标准：①有手术适应症，且经术后病理证实为宫颈癌；②术前未接受放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗；③临床资料及随访资料完整。排除标准：①国际妇产科协会（Federation Intemational of Gynecologie and Obstetrigue，FI-GO）分期Ⅱ～Ⅳ期；②合并代谢异常性疾病；③合并重要器官受损，如肺肝胆肾等；④合并急性心脑血管相关疾病；⑤合并其他恶性肿瘤；⑥合并严重精神疾病。依据纳入和排除标准，本研究共纳入100例宫颈癌患者，年龄31～68岁，平均（57.67±6.48）岁。取100例宫颈癌患者的宫颈癌组织及相应的癌旁正常组织（与肿瘤组织距离＞5 cm），均于手术切除后10 min内完成获取操作，-80℃保存备检。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂和仪器荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒、RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒均购自诺维赞生物公司，Biotek Epoch微量核酸定量仪购自美国Biotek公司，7500型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测FEZF 1-AS 1mRNA相对表达量依据RNA提取试剂盒说明书提取肿瘤组织和相应癌旁正常组织的总RNA，以定量分光光度法检测 D（260）/D（280），对 RNA 进行定量。严格依据逆转录试剂盒中的说明书完成反转录，合成cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行扩增，扩增体系20µl，主要包括正向引物2µl、反转录产物2 µl、反向引物2 µl、纯水4 µl和2×实时荧光定量PCR Mix试剂10µl。反应条件：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，共8个循环。实验重复3次，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，以2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。FEZF1-AS1正向引物：5'-TTAGGAGGCTTGTTCTGTGT-3'，反向引物 ：5'-GCGCAGGTACTTAAGAAAGA-3'；GAPDH正向引物：5'-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3'，反向引物：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

1.2.3 原位杂交染色法检测FEZF 1-AS 1的表达情况采取原位杂交寡核苷酸探针进行寡核苷酸探设计。首先将组织切片放在60℃烤箱里面烤片2 h，通过60℃二甲苯进行3次脱蜡处理，每次5 min；以梯度乙醇（分别为99.9%、96%、70%）水化，每次5 min；磷酸盐缓冲液洗5 min；焦碳酸二乙酯水洗5 min。对内源性过氧化物酶进行灭活处理，暴露mRNA核酸片段；然后进行预杂交及杂交操作，滴加二抗及过氧化物酶，予以显色处理。结果判定：FEZF1-AS1蛋白主要定位于细胞质，棕黄色染色为细胞阳性，按照染色强度和阳性细胞所占比例进行评分，染色强度：未着色计为0分，黄色染色计为1分，浅黄色染色计为2分，棕黄色染色计为3分；阳性细胞所占比例：阳性细胞所占比例＜10%计为1分，阳性细胞所占比例为11%～50%计为2分，阳性细胞所占比例为51%～70%计为3分，阳性细胞所占比例＞70%计为4分。将染色强度和阳性细胞所占比例相乘，0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为中度阳性，＞8分为强阳性。

1.3 随访方法

患者出院后，采取电话方式，对其进行为期3年的随访，期间以发生终点事件（死亡）为截止时间，详细记录患者生存情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验；相关性分析采用Spearman相关分析；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FEZF 1-AS 1 mRNA相对表达量的比较

宫颈癌组织中FEZF1-AS1mRNA的相对表达量为（6.15±0.74），明显高于癌旁正常组织的（4.02±0.53），差异有统计学意义（t=23.401，P=0.000）。

2.2 FEZF 1-AS 1阳性表达率的比较

宫颈癌组织中FEZF1-AS1阳性表达率为38.00%（38/100），明显高于癌旁正常组织的8.00%（8/100），差异有统计学意义（χ2=25.409，P=0.000）。

2.3 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中FEZF 1-AS 1相对表达量的比较

不同年龄、肿瘤直径、人乳头瘤病毒感染（human papilloma virus，HPV）情况和病理类型宫颈癌患者宫颈癌组织中FEZF1-AS1mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；低分化、有淋巴结转移的宫颈癌患者宫颈癌组织中FEZF1-AS1mRNA的相对表达量均明显高于中高分化、无淋巴结转移的宫颈癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中FEZF 1-AS 1mRNA相对表达量的比较

2.4 FEZF 1-AS 1的表达与临床病理特征的相关性

Spearman相关分析结果显示，FEZF1-AS1的表达与分化程度与呈负相关（r=-0.369，P＜0.05），与淋巴结转移呈正相关（r=0.718，P＜0.05）。

2.5 FEZF 1-AS 1表达与预后的关系

随访3年，宫颈癌患者宫颈癌组织FEZF1-AS1阳性表达患者生存26例，3年总生存率68.42%（26/38），低于FEZF1-AS1阴性表达患者的90.32%（56/62），差异有统计学意义（χ2=7.910，P＜0.05）。（图1）

图1 FEZF 1-AS 1阳性表达（ n=38）与FEZF 1-AS 1阴性表达（ n=62）宫颈癌患者的生存曲线

3 讨论

大量流行病学及分子生物学研究指出，高危型人乳头瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HRHPV）持续感染是宫颈癌与其癌前病变出现的主要原因，但HR-HPV感染并不是引起宫颈癌疾病唯一因素，人体基因改变更是该疾病发生发展重要影响因素[7-8]。LncRNA主要为转录本长度在200 nt以上的一类RNA分子，并不编码蛋白，通常以RNA形式于各类层面上（包括表观遗传调控层面、转录调控层面与转录后调控层面等）调控人体基因表达水平。基因表达的调控过程较复杂，一般需多个或共同因子一起参与进行，既往医学认为，LncRNA并不能发挥生物学功能，但近年来越来越多研究证实，LncRNA参与了人体X染色体沉默、染色质修饰、基因组印记、转录激活、核内运输及转录干扰等各类重要调控过程[9-10]。由于肿瘤细胞里面某些特定LncRNA呈异常表达，因此，特异型LncRNA表达水平能够作为肿瘤诊断及疗效评估的有效指标[11-12]。

FEZF1-AS1作为一种临床新发现LncRNA，在结直肠癌、胃癌、肝细胞癌等多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤基因诊断、临床治疗指导及预后评估等方面均存在较大的应用前景[13-15]。Zhang和Li[16]通过RT-PCR检测发现，宫颈癌患者肿瘤组织与细胞内FEZF1-AS1呈明显高表达，并依据FEZF1-AS1表达水平差异分为高表达组和低表达组，临床病理分析发现，FEZF1-AS1过表达与病理类型和肿瘤远处转移情况密切相关；对宫颈癌患者进行平均24个月的随访发现，FEZF1-AS1高表达患者整体生存率更低，术后生存时间更短；单因素分析显示，FEZF1-AS1高表达、低分化和远处转移均与较差的预后相关；多因素分析发现，FEZF1-AS1是宫颈癌患者预后重要独立预测因子。

本研究结果显示，宫颈癌组织中FEZF1-AS1mRNA的相对表达量高于癌旁正常组织，表明宫颈癌组织中FEZF1-AS1的表达上调。本研究结果显示，低分化、有淋巴结转移的宫颈癌患者宫颈癌组织中FEZF1-AS1mRNA的相对表达量均高于中高分化、无淋巴结转移的宫颈癌患者，表明组织分化程度、淋巴结转移情况可能是宫颈癌组织FEZF1-AS1表达影响因素。相关性分析显示，FEZF1-AS1的表达与分化程度与呈负相关，FEZF1-AS1的表达与淋巴结转移呈正相关，提示分化程度、淋巴结转移发生情况与宫颈癌组织FEZF1-AS1的表达密切相关。Kaplan-Meier生存分析显示，FEZF1-AS1阳性表达患者3年总生存率68.42%，低于FEZF1-AS1阴性表达患者的90.32%，表明FEZF1-AS1的表达与宫颈癌患者不良预后密切相关。但本研究纳入样本量较小，尚需进一步进行大样本临床研究进行验证。

综上所述，宫颈癌组织中FEZF1-AS1的表达上调，与分化程度、淋巴结转移情况相关，且可能与宫颈癌患者的预后有关。