一贯煎中川楝子佐制配伍对荷H22肝癌小鼠胃肠消化吸收功能的影响*

★ 余功 李璐 胡桥 崔玉顺 杨清跃 谢斌*（江西中医药大学 南昌 330004）

我国属于肝癌高发地区，每年死于肝癌仍有11万人，占全世界肝癌死亡人数的45%，亟需研发抗肝癌的有效药物［1］。中医认为肝癌患者临床表现多有虚阴肝郁。肝体阴而用阳，诸邪蕴积日久，极易耗伤肝阴，造成肝阴亏虚，不能制约亢阳，阳热壅盛，蕴久而化火，肝郁气滞则影响气血运行，酿痰生痰，使气滞、痰凝、血瘀等病理产物胶结壅塞于局部，日久则形成肿瘤［2］。故在肝癌的治疗中，多强调疏肝理气，滋补肝阴［3］。一贯煎为滋阴疏肝代表方，主治肝肾阴虚，血燥气郁而变生诸证，既能缓解肝阴虚所导致的肝阳上亢、气滞血瘀，又能能疏泄肝气，顺肝木条达之性，常用于肝癌的临床治疗当中，可改善肝癌患者临床症状，加快肿瘤消退速度，缩短治疗疗程，还能降低放化疗不良反应发生率，提高患者生活质量［4-5］。然本方中滋阴类中药多甘寒滋腻滋，过量使用常会妨碍脾胃运化功能，导致脾胃不健，消化力薄弱；内生湿热、痰湿，苔腻，多痰，或口中多津，舌润苔白；多次服用过量时即可能产生副作用，出现胸脘痞闷，或腹胀，食欲不振，大便稀薄或腹泻，或多痰唾，口中涎腻不爽，舌上多津，舌苔厚腻等。

川楝子性味苦寒，疏泄肝气，以调肝木之横逆，既疏泄肝气，又顺肝木条达之性，且制诸药滋腻碍胃之弊，为本方中佐制药，是本方有别于其他滋肝阴诸方的地不同之处。本研究基于前期一贯煎防治肝癌具有良好效果的前期研究成果［6-7］，通过对比研究一贯煎不同配伍对荷H22肝癌小鼠血清胃泌素（GAS）、胃动素（MLT）、胆囊收缩素（CCK）及血清D木糖含量的影响，探索川楝子佐制配伍在一贯煎抗肝癌中的作用，为临床辨证应用佐制配伍抗肿瘤提供新的思路。

1 材料

1.1 药物 一贯煎药物组成为当归10 g，北沙参10 g，地黄30 g，麦冬10 g，枸杞子12 g，川楝子5 g，购自江西省中医院中药房，中药饮片经江西中医药大学中药鉴定教研室邓可众教授鉴定为正品。将以上中药加10倍量的清水浸泡1 h后煎煮，水沸后以小火煎40 min，过滤；第2次加8倍量的清水煎煮，水沸后小火煎40 min，过滤，合并滤液，常压浓缩至33.5 mL（即1 mL药液含生药2.3 g）。一贯煎不含川楝子组，北沙参10 g，麦冬10 g，当归10 g，生地黄30 g，枸杞子12 g，常压浓缩至33.5 mL，灌胃每次0.2 mL。川楝子组：川楝子5 g常压浓缩至33.5 mL。每次灌胃0.2 mL。将上述药物冷却后密封，4℃保存备用。注射用环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号H32020857）。

1.2 动物和瘤株 SPF级KM小鼠50只，雄性，体质量（20±2）g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，合格证号：SCXK（苏）2016-0010。瘤株：小鼠H22肝癌原代细胞，购于ATCC细胞库（编号36470TM）。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准，批准号：JZLLSC2018-0060。

1.3 试剂 胎牛血清（中国医学科学院生物医学工程研究所，批号#TBD15HT）；DMEM高糖培养基（北京Solarbio公司，批号20170605）；胃动素（MLT）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号L181119970）；胃泌素（GAS）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号L181113366）；胆囊收缩素（CCK）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号L181113354）；血清D木糖检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号A035）。RIPA组织/细胞裂解液，PMSF（均由北京Solarbio公司提供，批号分别为201704119，20170330）。

1.4 仪器 波长酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；-80℃冰箱（美国Thermo公司）；摇床烘箱（上海福玛实验设备有限公司）；冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司）；CO2细胞培养箱（上海丙林电子科技有限公司）；紫外分光仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠H22肝癌细胞培养及造模方法 将小鼠H22肝癌细胞置于37℃、5%CO2培养箱中，用含体积分数10%FBS的DMEM培养基悬浮培养。取最佳生长状态的小鼠H22肝癌细胞，用无菌生理盐水调节密度至5×106个/mL。以0.2 mL/只（1×106个细胞/只）的接种量，无菌注入小鼠腹腔进行接种传代，于接种7～9d，小鼠腹部膨隆，出现腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接种。

2.2 动物模型 制作荷H22肝癌小鼠模型的建立［8］将腹部明显隆起的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，抽出瘤液以无菌生理盐水稀释后1 500 r/min离心5min，调整瘤细胞浓度为5×106个/mL，于小鼠右腋下行皮下无菌接种，接种量为每只0.2 mL/只。接种后第3天在小鼠右腋下接种部位可触摸到肿瘤硬块，成瘤率100%。

2.3 动物分组及给药方法 将小鼠随机分为模型组、CTX组、一贯煎组、一贯煎不含川楝子组、川楝子组，每组12只。模型组接种24 h后，以0.2 mL/只生理盐水灌胃；CTX组：接种24 h后，CTX以50 mg/（kg·d）剂量隔日腹腔注射；接种24 h后，分别给一贯煎组，一贯煎不含川楝子组，川楝子组以0.2 mL/只药物灌胃。造模前2周即开始按设计剂量灌胃给药，继续给药2周后，禁食12h后用3%D木糖灌胃，每只0.2 mL。造模结束后，眼眶取血法取血，3 000 r/min离心10 min，获得血清，然后处死各组小鼠，取肿瘤组织、胃组织、小肠组织。

2.4 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测胃黏膜上皮细胞中GAS、MLT、CCK的含量 从-80℃冰箱里取出肿瘤组织，待其解冻后取0.1g，用高温高压灭菌过的剪刀将其尽量剪碎，置于高温高压灭菌过的1.5 mL离心管中，加入1mL含PMSF的RIPA裂解液，用组织研磨机充分研磨后4℃，12 000 r/min离心20 min；取其上清液，设立检测管、空白管、标准管、标准空白管，再分别按照试剂盒说明书要求操作。最后在酶标仪中以450 nm波长测定各孔的A，然后根据标准孔A绘制标准曲线，按曲线方程计算各样品浓度值。

2.5 间苯三酚法检测血清D木糖的含量 -80℃冰箱里取出肿瘤组织，待其解冻后取0.1 g，用高温高压灭菌过的剪刀将其尽量剪碎，置于高温高压灭菌过的1.5 mL EP管中，加入1mL含PMSF的RIPA裂解液，用组织研磨机充分研磨后4℃，12 000 r/min离心20 min；取其上清液，设立检测管、空白管、标准管、标准空白管，再分别按照试剂盒说明书要求正规操作。最后在紫外分光仪中以450nm波长测定各孔的A，然后根据标准孔A绘制标准曲线，按曲线方程计算各样品浓度值。

2.6 统计分析 所有数据均用SPSS20.0软件分析整理，计量资料用（）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠肿瘤增殖的影响 与模型组比较，CTX组、一贯煎组、川楝子组、一贯煎不含川楝子组瘤重降低（P＜0.01）；与CTX组比较，一贯煎组、川楝子组、一贯煎不含川楝子组瘤重升高（P＜0.01）；与一贯煎组比较，川楝子组、一贯煎不含川楝子组瘤重升高（P＜0.05）。见表1。

表1 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠肿瘤增殖的影响（）

表1 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠肿瘤增殖的影响（）

注:与模型组比较，*P＜0.01；与CTX组比较，#P＜0.01；与一贯煎组比较，▲P＜0.05。

组别 n 瘤重/g模型组 10 1.934±0.450 CTX组 10 0.392±0.078*一贯煎组 9 0.997±0.051*#川楝子组 10 1.388±0.369*#▲一贯煎不含川楝子组 10 1.408±0.463*#▲

3.2 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠血清D木糖、CCK含量的影响 与模型组比较，一贯煎组、川楝子组血清D木糖含量升高（P＜0.01）；与CTX组比较，一贯煎组、川楝子组血清D木糖含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；与一贯煎组比较，一贯煎不含川楝子组血清D木糖含量降低（P＜0.01）。

与模型组比较，一贯煎组血清CCK含量升高（P＜0.05）；与CTX组比较，一贯煎组血清CCK含量升高（P＜0.05）；与一贯煎组比较，川楝子组与一贯煎不含川楝子组血清CCK含量降低（P＜0.05）。见表2。

表2 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠血清D木糖、CCK的影响（）

表2 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠血清D木糖、CCK的影响（）

注:与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与CTX组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与一贯煎组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别 n D木糖/mmol·L-1CCK/pg·mL-1模型组 10 0.469±0.072 83.959±2.301 CTX组 10 0.510±0.149 81.836±8.579#一贯煎组 9 0.707±0.077**## 90.144±7.351*川楝子组 10 0.629±0.113**# 85.04±3.085▲一贯煎不含川楝子组 10 0.563±0.098▲▲ 85.15±2.363▲

3.3 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠血清MLT、GAS含量的影响 与模型组比较，一贯煎组血清MLT含量升高（P＜0.01），CTX组血清MLT含量降低（P＜0.05）；与CTX组比较，一贯煎组、川楝子组、一贯煎不含川楝子组血清MLT含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；与一贯煎组比较，川楝子组、一贯煎不含川楝子组血清MLT含量降低（P＜0.05）。

与模型组比较，一贯煎组血清GAS含量升高（P＜0.01；与CTX组比较，一贯煎组比较，川楝子组GAS含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；与一贯煎组比较，川楝子组、一贯煎不含川楝子组血清GAS含量降低（P＜0.01）。见表3。

表3 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠血清MLT、GAS的影响（） pg/mL

表3 川楝子佐制配伍对荷H22小鼠血清MLT、GAS的影响（） pg/mL

注:与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与CTX组比较，#P<0.05，##P<0.01；与一贯煎组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

组别 n MLT GAS模型组 10 1 170.556±108.517 16.412±1.511 CTX组 10 1 012.434±179.106* 14.61±2.677一贯煎组 9 1 369.259±142.267**##23.742±2.428**##川楝子组 101 201.543±180.641##▲17.415±2.343#▲▲一贯煎不含川楝子组10 1 187.955±92.062#▲ 16.394±2.466▲▲

4 结论

川楝子性寒不燥，既能疏肝泄热、行气止痛，又顺肝木条达之性， 虽有“苦燥伤阴”之说，但配在滋阴养血为主的方药中，既可疏肝泄热、顺肝木条达之性，平其横逆，又能引诸药直达肝经。一贯煎在大量滋阴药（沙参、麦冬、当归、生地、构杞子）中，使用佐制药川辣子疏肝理气，宣泄郁火，使滋而不腻。故清代名医张山雷曰：“独加一味川楝子，以调肝木之横逆，能顺其条达之性，是为涵养肝阴无上之良药……口苦而燥，是上焦之郁火，故以川楝泄火，楝本苦燥，而入于大剂养液队中，反为润燥之用”，这正是本方有别于其他滋肝阴诸方的不同之点［9］。同时，川楝子性苦寒，可制诸药滋腻碍胃之弊，为佐制药。故在本方中，川楝子既为佐助药，又为佐制药，从而实现一贯煎补肝与疏肝相结合，在本方抑制肝癌中发挥了重要作用。

现代研究表明，川楝子中含有丰富的化学成分，具有驱虫、抗肉毒、抗肿瘤、抗病毒、抗菌消炎、抗氧化等诸多方面的药理作用［10-11］。近年来研究发现，川楝素具有抑制肿瘤细胞增生和凋亡的作用。如王鹏研究发现，川楝素可有效抑制P53+和 P53型人肝癌细胞增殖、诱导其凋亡的作用，且抑制强弱与浓度呈正相关性［12］。贾英杰教授常用川楝子、延胡索，取金铃子散之配伍，治疗肝癌伴腹痛、腹胀患者，疗效显著［13］。

胃肠激素对消化吸收功能具有重要的调节作用，GAS主要由胃窦和十二指肠G细胞分泌，可刺激消化腺分泌外，促进胃平滑肌的收缩，加强胃肠道运动，MTL能够兴奋平滑肌肌，进一步提高胃肠道收缩力和张力，促进胃肠运动和胃排空。CCK可促进胃酸与胆汁分泌，还可以促胆囊收缩，排出胆汁，促进胰腺腺泡分泌各种消化酶［14］。本研究结果表明，一贯煎组、川楝子组、一贯煎不含川楝子组均能有效抑制荷H22肝癌小鼠肿瘤增殖，一贯煎组与川楝子组抑瘤效果优于一贯煎不含川楝子组，一贯煎能升高荷H22小鼠血清D木糖、CCK、GAS、MLT含量，具有明显胃肠保护与促进消化吸收功能，单独使用川楝子亦能升高荷H22小鼠血清D木糖含量，能明显的促进胃肠消化吸收。该研究结果提示川楝子佐制配伍可有效提高一贯煎药物功效，其机制可能与川楝子能疏理肝气，防止其它滋阴药物碍胃，促进药物吸收有关。