宫内发育迟缓大鼠胰腺骨保护素的表达及其对胰腺发育的影响

唐诗，辛颖

（中国医科大学附属盛京医院小儿内分泌遗传代谢科，沈阳 110004）

宫内发育迟缓 （intrauterine growth retardation，IUGR） 是指胎儿未能达到其遗传基因影响下应有的大小。IUGR可增加成年期发生胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢综合征的风险［1-3］，其机制尚不十分清楚。目前普遍被认可的机制是“节俭表型假说”［2］，该假说指出胎儿及新生儿早期营养不良会导致胰岛β细胞的发育异常及胰岛功能损伤，这种解剖结构和功能的变化可能导致胰岛素敏感性降低，进而成年后发生2型糖尿病。

骨保护素 （osteoprotegerin，OPG） 是肿瘤坏死因子受体家族的成员，1997年由SIMONET等［4］发现，因具有保护骨的作用而得名。近年的研究［5-8］发现，OPG在人类及大鼠胰岛中均有表达。RIECK等［5］通过芯片筛查发现OPG在怀孕、肥胖和β细胞损伤动物模型中的表达水平均升高，提示OPG与胰岛β细胞之间存在密切的关系。但OPG对胰岛β细胞的具体影响目前仍存在争议［6-8］。

IUGR与OPG相关性的研究鲜有报道，且均集中于血清中OPG水平与IUGR关系的研究［9-11］。临床研究［9-10］表明，出生后1～4 d，IUGR组和健康组母亲和婴儿血清中OPG水平无差异；而动物研究［11］发现，IUGR幼鼠的血清OPG水平显著低于正常幼鼠。目前，尚无针对IUGR个体生长发育过程中胰腺组织中OPG表达情况的研究。本研究拟检测新生至成年期IUGR大鼠胰腺组织中OPG蛋白及mRNA的表达水平，旨在探讨OPG对IUGR大鼠胰腺发育的影响。

1 材料与方法

1.1 建立IUGR大鼠动物模型

将体质量 （body weight，BW） 250～300 g的健康雌性处女Wistar大鼠 （辽宁长生生物技术有限公司）以雌雄比例4︰1与Wistar雄性大鼠合笼。将已受孕的大鼠按照喂养饲料不同随机分成2组：孕期全程低蛋白饮食组 （蛋白含量8%） 和标准饲料饮食组（蛋白含量20%）。低蛋白饮食组母鼠喂养至分娩，得到出生BW低于相应孕周第10百分位数以下的子鼠，即IUGR鼠，作为IUGR组；标准饲料饮食组母鼠喂养至分娩，得到正常子鼠，作为正常对照组 （CON组）。

选择生后第1天、第1周、第3周及第12周作为研究时间点。为了排除雌激素的影响，选择雄性大鼠为研究对象。每个时间点、每组大鼠均为10只。

1.2 HE染色观察胰岛形态

取大鼠胰腺组织，固定并石蜡包埋，制3 μm厚切片。二甲苯及梯度乙醇脱蜡；苏木素染色5 min，自来水冲洗30 min返蓝；伊红复染1.5 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察胰岛形态。

1.3 Ki-67与insulin免疫荧光双染检测胰岛β细胞增殖情况

将石蜡切片依次放入二甲苯及梯度乙醇中脱蜡，Tris-EDTA修复液微波7 min煮沸修复，驴血清室温封闭40 min，加入抗Ki-67抗体 （1︰200，美国Abcam公司） 及抗insulin抗体 （1︰50，中国武汉博士德生物工程有限公司），4 ℃孵育过夜；次日复温后，驴抗小鼠Alexa Fluor 488 （1︰400，美国Abcam公 司） 与驴抗兔Alexa Fluor 594 （1 ︰ 400，美 国Abcam公司） 室温孵育2.5 h，DAPI染核5 min，甘油封片后在免疫荧光共聚焦显微镜 （FV1000S，日本Olympus公司） 下观察并拍照。每组选取5只大鼠，计算各组Ki-67+细胞数/总细胞数。

1.4 Western blotting检测胰腺组织OPG蛋白表达水平

用RIPA裂解液提取大鼠胰腺组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度并变性。40 μg蛋白上样，10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，恒压电泳湿转电转法将蛋白质转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭PVDF膜2 h，分别加入兔抗大鼠OPG抗体 （1︰1 000，美国Abcam公司） 和兔抗大鼠GAPDH抗体 （1︰6 000，美国Proteintech公司），4 ℃孵育过夜，山羊抗兔二抗 （1︰5 000，美国Proteintech公司）室温孵育2 h，ECL显色，应用Image J软件进行蛋白灰度分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。

1.5 实时PCR检测胰腺组织OPG mRNA表达水平

提取总RNA，应用PCR反转录试剂盒 （日本TaKaRa公司） 逆转录合成cDNA。采用PCR扩增试剂盒 （日本TaKaRa公司） 进行PCR扩增，反应条件为：95℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。PCR引物序列如下：OPG，F 5’-AAGTGGCTGTGCTGTGCACTC-3’，R 5’-CGGTTTCTGGGTCATAATGCAA-3’；GAPDH，F 5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，R 5’-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3’。GAPDH作为内参照基因，表达量用2-ΔΔCt计算。

1.6 ELISA法检测血清胰岛素水平

按照胰岛素ELISA试剂盒 （武汉华美生物有限公司） 说明书操作，96孔板中加入标准品和待测样品，37 ℃孵育2 h，弃液体；加入生物素标记抗体工作液，37 ℃孵育1 h，洗涤；加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，37 ℃孵育1 h，洗涤；加入底物溶液，37℃避光显色15～30 min；加入终止溶液终止反应；使用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度值。

1.7 胰岛素抵抗指数 （homeostasis model assessmentinsulin resistance index，HOMA-IR） 计算

心脏穿刺取血，用快速生化血糖仪 （拜安捷，德国拜耳公司） 检测各组大鼠空腹血糖 （fasting blood glucose，FPG）。计算HOMA-IR=［空腹胰岛素（fasting insulin，FINS） ×FPG］/22.5。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 宫内营养不良对IUGR子鼠生长及胰腺发育的影响

IUGR组大鼠出生BW明显低于CON组，这种情况一直持续至生后3周，哺乳期后，IUGR组出现生长追赶，至12周时，IUGR组与CON组BW无统计学差异 （P=0.37）。IUGR组大鼠胰腺质量 （pancreas weight，PW） 及胰腺质量/BW比值 （pancreas weight/body weight ratio，PW/BW） 在生后1 d及1、3、12周时均低于CON组，差异有统计学意义 （P< 0.01，P<0.01，P< 0.01，P=0.01）。见表1。

表1 CON组及IUGR组大鼠体质量、胰腺质量比较 （n=6）Tab.1 Comparison of rats’body weight and pancreas weight between CON group and IUGR group （n=6）

HE染色结果显示，与CON组相比，新生IUGR大鼠胰岛组织松散，胰岛面积明显低于对照组。生后1、3、12周时，IUGR组胰岛细胞团体积亦小于CON组。见图1。

图1 CON组和IUGR组胰腺组织HE染色结果 ×400Fig.1 HE staining of rats pancreas in CON and IUGR groups ×400

进一步通过免疫荧光双染的方法测定子鼠胰岛β细胞增殖情况，其中Ki-67和insulin共表达的部分即提示胰岛β细胞增殖。结果表明，在生后1 d及1、3、12周时，IUGR组胰岛β细胞增殖水平明显低于CON组 （P< 0.01）。见图2。

2.2 宫内营养不良对IUGR大鼠胰岛功能的影响

图2 CON组和IUGR组胰腺免疫荧光双染结果 （n=5）Fig.2 Immunofluorescent staining of rats’ pancreas in CON and IUGR groups （n=5）

表2 CON组及IUGR组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数比较 （n=6）Tab.2 Comparison of rat fasting blood glucose，fasting insulin and homeostasis model assessment-insulin resistance index between CON group and IUGR group （n=6）

不同时间点2组大鼠FPG、FINS及HOMA-IR的结果如表2所示，出生后1 d、1周、3周时，IUGR组大鼠FPG水平、FINS水平及HOMA-IR与CON组比较无统计学差异。生后12周，IUGR组大鼠FPG水平虽略高于CON组，但无统计学差异；而其FINS水平及HOMAIR显著高于CON组，差异有统计学意义 （P< 0.01）。提示IUGR大鼠在生后12周时存在高胰岛素血症及胰岛素抵抗。

2.3 IUGR大鼠胰腺中OPG蛋白及mRNA的表达情况

Western blotting和实时PCR结果显示，生后1 d及1、3、12周时，IUGR组OPG蛋白及mRNA的表达水平均低于CON组，其中生后1 d及12周的差异尤为显著 （P< 0.01）。见图3、4。

3 讨论

胎盘发育异常、宫内乏氧及宫内营养不良等均会导致胎儿IUGR［12-13］。胎儿期与新生儿早期胰岛β细胞分裂加快、数目增多，这一过程受营养物质的调节，营养物质的数量或质量是保证胰岛β细胞发育的基础。雌性大鼠妊娠期给予低蛋白饮食可使新生大鼠生长发育迟缓，并影响胎鼠胰岛β细胞大小、增殖及功能成熟，造成β细胞缺陷。本研究发现，在生长发育的各个阶段，IUGR大鼠的胰腺发育均较对照组迟缓，表现为胰腺质量低、胰岛细胞团体积减小、胰岛β细胞增殖水平下降。

胰岛β细胞的数量和功能与糖尿病的发生有密切的关系。IUGR个体胰岛β细胞缺陷在2型糖尿病发生中的作用一直受学者关注［14］。临床研究［15-16］也发现，IUGR的患儿在儿童期和成人期会出现胰岛素敏感性下降或胰岛素抵抗。本研究发现，IUGR大鼠在生后12周时出现了高胰岛素血症及胰岛素抵抗。

图3 CON组和IUGR组大鼠胰腺组织OPG蛋白表达 （n=6）Fig.3 OPG protein expression in pancreas of rats in CON and IUGR groups （n=6）

图4 CON组和IUGR组大鼠胰腺组织OPG mRNA表达 （n=5）Fig.4 OPG mRNA expression in pancreas of rats in CON and IUGR groups （n=5）

近年来的研究表明，OPG与糖尿病密切相关。2型糖尿病患者血中OPG水平明显高于对照组［17］，但机制尚不清楚，可能与胰岛素抵抗的炎症状态有关［18］，也可能与糖尿病血管病变有关［19］。OPG及其配体核因子κB受体活化因子配体 （receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL） 在肝脏中均有表达［20］。RANKL可与核因子κB受体活化因子 （receptor activator of nuclear factor κB，RANK） 结 合，激活核因子κB （factor nuclear facto κB，NF-κB） 及其下游的炎症信号通路，引起肝脏胰岛素抵抗。而OPG做为RANKL的诱饵受体，竞争性地与RANKL结合，阻止NF-κB及其下游信号通路，进而改善糖代谢。这一结论在临床研究［21］中也得到了证实。

研究［6］表明，在胰腺中，白细胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factorα，TNF-α） 可介导OPG的产生，而OPG则通过抑制P38分裂原激活的蛋白激酶 （mitogen activated protein kinases，MAPK） 的磷酸化，使胰岛β细 胞免受损伤，可见OPG具有保护胰岛β细胞的作用。KONDEGOWDA等［7］认为，OPG在催乳素介导的胰岛β细胞再生中起关键的作用，可以促进幼年、老年及糖尿病大鼠胰岛β细胞增殖。而TOFFOLI等［8］则认为OPG可改变胰岛β细胞形态并造成胰岛功能损伤。本研究发现，OPG在正常大鼠及IUGR大鼠胰腺均有表达，但新生儿期 （生后1 d）、幼年期 （生后1周、3周）及成年期 （生后12周） IUGR大鼠胰腺中OPG蛋白及mRNA水平均低于同期正常大鼠。

综上所述，本研究结果表明，IUGR大鼠胰腺中OPG蛋白及mRNA表达水平下降，可能是引起其胰腺发育不良、胰岛β细胞增殖水平下降及成年期胰岛素抵抗的原因之一。