MEKK3与宫颈癌患者凋亡抑制基因bcl-2表达的相关性研究

蒋丹 舒楚强 龚颖萍

近些年随着生活压力的增大，宫颈癌的发生持续增高，逐渐呈现年轻化的趋势，对我国的女性的身心健康及生活质量产生了重大影响[1,2]。但目前临床上常应用的脱落细胞检测对宫颈癌的阳性预测率较低，因此寻找有效诊断宫颈癌发生发展的分子标志物对患者的早期诊断、治疗尤为重要。有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(MEKK3)属于一种有丝分裂原活化蛋白3激酶家族中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MEKK3会在溶血磷脂酸、白细胞介素-1的介导下会激活细胞外信号调节激酶、p38、JNK所在内的MAPKs、核转录因子信号通路，通过激活上述通路，调节通路信号因子，参与肿瘤的发生发展过程[3]。B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)属于一种凋亡抑制基因，可对细胞的凋亡进行抑制，bcl-2通过抑制细胞的凋亡而促进细胞的增殖，核转录因子被激活后会对bcl-2起到调控作用，参与肿瘤的发生[4]。在本文研究中检测MEKK3在宫颈癌患者中的表达，并分析MEKK3与凋亡抑制基因bcl-2的相关性，为临床上宫颈癌的诊断提供新方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年12月我院收治的宫颈癌患者30例，年龄30～65岁，平均年龄(43.9±2.3)岁；鳞癌21例，腺癌9例；FIGO分期Ⅰ期患者5例，Ⅱ期患者8例，Ⅲ+Ⅳ期患者17例；肌层浸润>1/2患者16例，肌层浸润≤1/2患者14例；低分化患者10例，中-高分化患者20例。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：所有患者均病理学确诊患有宫颈癌，均未接受过放疗、化疗、免疫治疗。

1.2.2 排除标准：排除合并其他肿瘤的患者；排除病历资料不全患者。本文研究患者及其家属均知情，签署知情通知书。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：取所有宫颈癌患者手术切除癌组织及癌旁组织标本，将制作的组织标本采用40 g/L的多聚甲醛进行固定，并进行常规石蜡包埋，厚度为3 μm，连续切片作免疫组化标记。正常结肠黏膜组织，通过活检取块进行制作标本。采集患者血液样本，使用转速为2 000 r/min的离心机，离心处理20 min，分离血清，放入洁净的EP试管中，在-20℃环境中保存，待用。

1.3.2 免疫组化染色:将石蜡切片样本放在二甲苯中脱蜡处理10 min，将二甲苯更换后再放置10 min，然后梯度酒精水化；加入蛋白酶修复液，在37℃的恒温冰箱中孵化30 min，弃抗原修复液；切片移入湿盒中加入浓度为3%的H2O2，去过氧化物酶封闭液，恒温冰箱孵育10 min，采用PBS淋液冲洗；加入适量的山羊血清，在室温环境下封闭30 min；用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，然后再加入二抗，室温孵育1 h，采用PBS淋液冲洗；经过DAB显色处理10 min，在显微镜下观察阳性反应，之后脱水并封片处理。

1.3.3 结果判定:MEKK3在细胞质中有蓝紫色颗粒沉着为阳性，bcl-2在细胞浆或细胞核为黄色或棕褐色为阳性。按照免疫组化染色显色程度、阳性细胞占癌细胞、癌旁细胞的百分率进行判定阳性表达率，其中阳性细胞数≥10%、显色较强的为阳性，反之为阴性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件，其中计数资料采用百分率描述，组间比较采用χ2检验，多组间比较采用F值检验，P<0.05则说明差异具有统计学意义。相关性采用Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 MEKK3、bcl-2在宫颈癌癌组织及癌旁组织中的表达比较 宫颈癌癌组织中MEKK3、bcl-2阳性表达率均高于癌旁组织，具有统计学差异(P<0.05)。见表1，图1。

表1 MEKK3、bcl-2在宫颈癌癌组织及癌旁组织中的阳性表达比较 n=30,例(%)

MEKK3癌组织 MEKK3癌旁组织

bcl-2癌组织 bcl-2癌旁组织

图1 MEKK3、bcl-2在宫颈癌癌组织及癌旁组织中的表达(免疫组化×200)

2.2 MEKK3与宫颈癌患者临床病理特征的关系 MEKK3与宫颈癌患者年龄、组织学类型无关，无统计学差异(P>0.05)；MEKK3与宫颈癌患者FIGO分期、肌层浸润、淋巴结转移、分化程度有关，MEKK3在Ⅲ+Ⅳ期、肌层浸润>1/2、有淋巴结转移、中-高分化的宫颈癌患者中阳性表达率高于在Ⅰ期、Ⅱ期、肌层浸润≤1/2、无淋巴结转移、低分化的宫颈癌患者中阳性表达率，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 MEKK3与宫颈癌患者临床病理特征的关系 例(%)

2.3 bcl-2与宫颈癌患者临床病理特征的关系 bcl-2与宫颈癌患者年龄、组织学类型无关，无统计学差异(P>0.05)；bcl-2与宫颈癌患者FIGO分期、肌层浸润、淋巴结转移、分化程度有关，bcl-2在Ⅲ+Ⅳ期、肌层浸润>1/2、有淋巴结转移、中-高分化的宫颈癌患者中阳性表达率高于在Ⅰ期、Ⅱ期、肌层浸润≤1/2、无淋巴结转移、低分化的宫颈癌患者中阳性表达率，具有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 bcl-2与宫颈癌患者临床病理特征的关系 例(%)

2.4 MEKK3、bcl-2之间的相关性分析 对MEKK3、bcl-2之间进行相关性分析，MEKK3与bcl-2之间呈正相关(r=0.521,P=0.003)。见图2。

图2 MEKK3、bcl-2之间的相关性

3 讨论

宫颈癌的发生属于一个多阶段、多步骤的较为复杂的过程，与多种分子、基因、信号通路对细胞凋亡的调节作用有关[5]。因此在本文研究中检测MEKK3在宫颈癌中的表达及其与凋亡抑制基因bcl-2的关系进行分析，以阐明MEKK3与宫颈癌患者凋亡抑制基因bcl-2的关系，为宫颈癌的诊治提供新方向。

MEKK3在丝裂原活化蛋白激酶中的胞外调节蛋白激酶通路中发挥着重要的作用，当MEKK3磷酸化胞外调节蛋白激酶通路中的MEK后会激活胞外调节蛋白激酶通路，而MEKK3也可磷酸化激活MKK4对应激活化蛋白激酶通路进行激活[6-8]。有研究表明，MEKK3可以通过作用于IL-1R-TLR通路而介导IL-6的表达，MEKK3在IL-1R-TLR4信号通路中可与TRAF6之间形成复合物，而此时形成的复合物是一种IL-1R、TLR4所诱导产生IL-6的必要复合物[9,10]。MEKK3还可通过IL-1R-TLR通路所介导的IKK-NF-κB信号转导通路，促进转录因子的快速活化，而转录因子可作用于多种基因，而对相应的基因的表达进行调控，最终参与恶性肿瘤的发生和发展[11]。目前已经有研究表明，MEKK3参与多种肿瘤的发生，殷宪刚等[12]研究表明MEKK3的异常表达与食管鳞癌的发生、浸润转移及预后相关。郭勇峰等[13]研究认为MEKK3参与早期子宫颈癌的发生发展，且与患者的预后相关。在本文研究中检测宫颈癌癌组织与癌旁组织中MEKK3的阳性表达率，并分析MEKK3与宫颈癌患者临床病理特征的关系，结果显示，MEKK3在宫颈癌癌组织中阳性表达率较高，且与患者FIGO分期、肌层浸润、淋巴结转移、分化程度有关，此结果说明，MEKK3高表达于宫颈癌中，参与宫颈癌的发生发展。

核转录因子会通过调控肿瘤抑制基因的表达而对抑癌基因多介导的细胞凋亡起到抑制作用，此结果提示着核转录因子可对抑制凋亡基因起到调控作用[14]。bcl-2属于一种细胞凋亡抑制基因，最早发现于白血病、淋巴瘤中，临床上有研究表明，bcl-2通过抗氧化、抑制细胞内Ca+浓度升高以及对细胞核转运进行封闭等作用抑制细胞的凋亡[15,16]。有研究表明，bcl-2主要在细胞膜的线粒体、粗面内质网上存在，可对细胞的生命周期及逆行延长，并对凋亡刺激因素的耐受性进行增强，最终起到抑制凋亡的作用[17]。另外bcl-2发挥作用是以二聚体的形成，若其形成同聚体后会对细胞凋亡进行抑制。bcl-2的异常的高表达会抑制细胞的凋亡；促使受损细胞获得永生性，可与生长抑制基因、增殖基因产生协同作用，在上述基因的共同调控下促进肿瘤的发生[18]。目前有多数研究均表明，bcl-2参与多种肿瘤的发生，刘平贤等[19]在其研究中认为bcl-2参与乳腺癌的发生，而陶蕾等[20]认为通过靶向bcl-2会诱导胰岛β细胞的凋亡。在本文研究中检测宫颈癌癌组织与癌旁组织中bcl-2的阳性表达率，并分析bcl-2与宫颈癌患者临床病理特征的关系，结果显示，bcl-2在宫颈癌癌组织中阳性表达率较高，且与患者FIGO分期、肌层浸润、淋巴结转移、分化程度有关，此结果说明，bcl-2高表达于宫颈癌中，参与宫颈癌的发生发展。

另外本文还对MEKK3、bcl-2之间的相关性进行分析，结果显示MEKK3与bcl-2之间呈正相关，二者在宫颈癌的发生发展中具有协同作用。

综上所述，MEKK3在宫颈癌中呈现高表达，且与凋亡抑制基因bcl-2之间具有一定的相关性，两者在宫颈癌的发生发展中具有协同作用。