董甲庆,范丽,李凯旋,陈玉林
西安医学院第二附属医院药剂科1、消化科2、检验科3、营养科4,陕西 西安 710038
目前临床用于治疗溃疡的药物应用最广泛的是雷尼替丁。该药具有速效和长效的特点,对胃及十二指肠溃疡的疗效很高,能有效抑制各类刺激引起的胃酸分泌及基础胃酸分泌,是一种强效组胺H2受体拮抗剂,阻断组胺与胃黏膜壁细胞上的H2受体结合,降低胃酶的活性,同时抑制胃蛋白酶的分泌,但对胃泌素及性激素的分泌不产生影响[1]。主要用于胃及十二指肠溃疡、反流性食管炎、手术后溃疡、胃泌素瘤及其它胃酸分泌性疾病的治疗,也可用于预防应激性溃疡。
近年来研究发现,雷尼替丁联合其他药物在治疗幽门螺杆菌阳性的十二指肠溃疡、荨麻疹和脑出血后应激性溃疡等方面效果明显要优于其他同类药物。其作用迅速、药效良好、价格低廉的优势使得雷尼替丁在临床上使用广泛[2]。
雷尼替丁口服吸收效果不受食物和抗酸药的影响,存在首过效应,生物利用度为50%。单次口服雷尼替丁0.15 g后1~3 h达峰,峰浓度(Cmax)为400~500 ng/mL,表观分布容积约为1.9 L/kg,作用可维持8~12 h,血浆蛋白结合率约为15%。在体内分布广泛,能透过血-脑屏障。其半衰期为2~3 h,肾功能不全时,半衰期会相应延长。大部分以原型药形式经肾排泄,肾脏清除率为7.2 mL/(kg·min),30%经肝内代谢转化为S-氧化物、N-氧化物和去甲基雷尼替丁。
雷尼替丁临床常见不良反应有头晕、头痛、恶心、乏力、皮疹、便秘等;少数患者服药后有肝功能轻度损伤现象,停药后症状即消失。其对中枢神经、性腺功能和肾功能不良反应较轻微。
目前关于血浆中雷尼替丁的测定方法有液相色谱串联质谱(LC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、微透析一毛细管电泳联用技术等[3-9]。HPLC因其方法简单,相比于LC-MS其仪器要求低,方便操作,在定量分析方面足以满足生物样品分析要求,因此本研究拟采用标准曲线、最低定量限、回收率、批间和批内精密度、稳定性等参数对HPLC法检测血浆中雷尼替丁浓度的准确性及可靠性进行方法学验证。
1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪(Agilent 1100);紫外检测器(G1314A VWD);MILLIPORE超纯水机(美国MILLIPORE公司);5804R高速低温离心机(德国Eppendorf公司);XS105DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。盐酸雷尼替丁标准品(中国药品生物制品检定所,批号100163-201006);甲硝唑标准品(中国药品生物制品检定所,批号100191-200606);色谱纯为甲醇,其他试剂均为分析纯。
1.2 色谱条件及样品处理
1.2.1 分析方法及色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 m);流动相:甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液-三乙胺(12.5:87.5:0.06,V/V/V);检测波长:320 nm;流速为1.2 mL/min;柱温:25℃;进样量:30 L;内标:10μg/mL甲硝唑。
1.2.2 血浆样品处理 吸取血浆样品200µL,加入甲硝唑20µL,10μg/mL混匀,再加入10%高氯酸100 µL,涡旋振荡1 min,然后14 000 r/min离心5 min,取上层清液150µL转移至进样瓶进样,30 L分析。
1.3 方法学验证
1.3.1 储备液制备 精密称取盐酸雷尼替丁标准品11.16 mg(约相当于雷尼替丁10.00 mg),用甲醇/水(50/50)定容至10 mL,即得雷尼替丁标准储备液(1 mg/mL),置于4℃冰箱储存备用。精密称取甲硝唑标准品5 mg,用甲醇/水(50/50)定容至10 mL,即得甲硝唑标准储备液(0.5 mg/mL),置于4℃冰箱储存备用。
1.3.2 专属性实验 专属性是指生物样品中存在的其他成分在分析检测过程中不干扰样品的检测,能够准确、专一的检测样品。本试验收集了6个不同来源的血浆对雷尼替丁是否存在干扰进行检测,结果发现在本试验条件下,雷尼替丁和内标甲硝唑相互无干扰,6个不同来源的血浆中杂质不干扰样品峰,测定条件下雷尼替丁和内标的保留时间分别约为9.363 min和10.79 min,说明该方法专属性较高。在此条件下所测得的结果能代表待测成分浓度。
1.4 统计学方法 应用SPSS24.0软件进行统计学分析,测定的血药浓度以均数±标准差(x-±s)表示,采用DAS3.2.6软件非房室模型法计算药代动力学参数,绘制色谱曲线图。
2.1 血浆中雷尼替丁标准工作曲线 标准曲线反映的是所测定样品浓度与仪器响应值之间的关系,一般用回归方程及相关系数来评价线性关系,标准曲线高低浓度范围为定量范围。本试验标准曲线:精密吸取雷尼替丁标准储备液制成系列标准工作液:25 000 ng/mL、20 000 ng/mL、10 000 ng/mL、5 000 ng/mL、2 000 ng/mL、1 000 ng/mL、500 ng/mL,分别吸取工作液20µL,加空白人血浆180µL使其中雷尼替丁浓度为2 500 ng/mL、2 000 ng/mL、1 000 ng/mL、500 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL的血浆标准品。按“血浆样品处理”项下处理后,在“分析方法及色谱条件”下,以血浆中雷尼替丁的浓度值为横坐标,待测化合物与内标化合物峰面积比(Area Ratio)为纵坐标,检测标准曲线中各浓度点的样本,记录样品峰面积,作直线回归(加权系数为Quadratic(Amnt)),得到雷尼替丁回归方程为:y=1.374 802 92x+0.007 277 1(r=0.998 80),见表1。
表1 标准曲线中雷尼替丁与内标峰面积比值与浓度
2.2 最低定量限实验 定量下限表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度,是指标准曲线上的最低浓度点,即LLOQ。应满足测定3~5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10~1/20时的药物浓度。实验中取180μL空白人血浆,加入雷尼替丁(500 ng/mL)标准工作液20µL,使雷尼替丁浓度为50 ng/mL,按“血浆样品处理”进行操作,记录样品与内标峰面积,计算两者比值,依照标准工作曲线计算相应的药物浓度,以此为最低定量限(LLOQ)指标。结果见表2及图1。
表2 雷尼替丁的血浆最低定量限试验(n=5)
图1最低定量限色谱图
2.3 精密度和准确度实验 精密度是指在确定的分析条件下,相同介质中浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批间和批内RSD来考察方法的精密度。准确度是指在确定的分析条件下,测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度(即质控样品的实测浓度与真是浓度的偏差),重复测定已知浓度分析物样品可获得准确度。首先精密吸取雷尼替丁标准储备液制成系列标准工作液:1 000 ng/mL、5 000 ng/mL、20 000 ng/mL,分别精密吸取工作液20μL加入空白人血浆180μL,使其中雷尼替丁的浓度为100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血浆标准品。按“血浆样品处理”项下操作,记录样品与内标峰面积,计算两者比值,代入同一条标准工作曲线计算相应的药物浓度,以此为批间和批内变异指标。测得血浆中批内变异和3个分析批的批间变异,见表3、表4。
2.4 回收率测定 分析物的提取回收率是以生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以纯标准品产生的响应值,检测高中低三个浓度的提取回收率,其结果应当精密和可重现。按要求测定低、中、高(100 ng/mL、500 ng/mL、2000 ng/mL)3个浓度的质控血浆样品各5份,按上述“血浆样品处理”方法处理后,得到样品峰面积A1,同时用流动相稀释配制成与血浆质控样品理论进样溶液相同浓度的溶液进样分析,得到样品峰面积A2;以A1/A2的比值求算雷尼替丁的绝对回收率,见表5。
表3 雷尼替丁的血浆方法学批内精密度试验(n=5)
表4 雷尼替丁的血浆方法学批间精密度试验(n=15)
表5 血浆中雷尼替丁绝对回收率
2.5 稳定性试验 样品稳定性应根据不同存放条件即在室温、冰冻或冻融条件下进行稳定性检测,以确定生物样品的存放条件及时间。
2.5.1 血浆冻融稳定性 取180μL空白人血浆,加入不同浓度的雷尼替丁标准液20μL,使其中雷尼替丁的浓度为100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血浆标准品,放置-40℃冰箱保存,待冻结后室温解冻,如此重复3次后测定血浆中药物浓度,见表6。
2.5.2 血浆样品8 h放置稳定性 取180μL空白人血浆,加入不同浓度的雷尼替丁标准液20μL,使其中雷尼替丁的浓度均为100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血浆标准品,室温放置8 h后测定血浆中药物浓度,见表7。
2.5.3 血浆样品处理后24 h放置稳定性考察 取180μL空白人血浆,加入不同浓度雷尼替丁标准工作液20μL,使其中雷尼替丁的浓度为100 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL的血浆标准品,按“血浆样品处理”进行操作,将样品在自动进样器(室温)中放置24 h后进行分析检测,见表8。
表6 雷尼替丁的血浆样品冻融稳定性考察试验(n=5)
表7 血浆样品室温8 h放置雷尼替丁的稳定性考察试验(n=5)
表8 雷尼替丁血浆处理样品自动进样器内24 h放置稳定性考察试验(n=5)
本文使用方法学的标准曲线、最低定量限、回收率、批间和批内精密度、稳定性等指标对高效液相色谱法测定血浆中雷尼替丁浓度的准确性进行验证。发现6个不同来源的血浆中杂质不干扰样品峰,而测定条件下雷尼替丁和内标的保留时间分别约为9.4 min和10.8 min,说明该方法专属性较高,在此条件下所测得的结果能代表待测成分浓度。使用雷尼替丁标准溶液和空白血浆制备不同浓度的血浆保准品,得出血浆雷尼替丁浓度标准曲线y=1.374 802 92x+0.007 277 1(r=0.998 80)。由标准曲线计算得到雷尼替丁的血浆最低定量限为50 ng/mL。接着由高中低三个浓度质控血浆样样品峰面积与用流动相稀释配制成与血浆质控样品峰面积的比值,计算得到雷尼替丁的绝对回收率为90.2%~94.1%。对高中低三个浓度批间和批内精密度测定试验结果,雷尼替丁的日间和日内RSD均小于10%,可证明HPLC测定雷尼替丁浓度准确可靠。血浆样品的冻融稳定性、8 h室温放置稳定性、血浆处理样品24 h放置稳定性试验均未见雷尼替丁样品发生明显降解,符合生物样品的分析要求。
通过对HPLC测定血浆中雷尼替丁浓度的方法学验证,可以得出本文中所建立的方法学科学可靠,能够准确测定雷尼替丁浓度的结论。