没食子酸在Caco-2细胞模型中的吸收转运研究

程珍珍，周本宏,，姜 姗，金 丹

(1.武汉大学药学院，湖北 武汉 430072；2.武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060)

石榴皮是石榴科植物石榴PunicagranatumL.的干燥果皮，是一种常见的中药，具有止血、驱虫、涩肠止泻的功效[1]。没食子酸是石榴皮中没食子鞣质的重要生物活性成分之一，是结构最为简单的天然多酚物质[2]。没食子酸具有抗肝纤维化、抗糖尿病、抗肿瘤等作用[3-4]。Caco-2细胞是来源于人类结肠直肠癌，Caco-2细胞模型被广泛地用于评估药物肠道吸收特征和研究药物的转运吸收[5-6]。目前对没食子酸的吸收转运机制及其影响转运的因素研究甚少。因此，本研究建立Caco-2细胞模型，对没食子酸的转运吸收方式以及影响因素进行研究，以初步阐明没食子酸吸收转运机制。

1 材料和方法

1.1 材料没食子酸对照品(成都曼斯特，批号：16022801，纯度99%);细胞 Caco-2细胞株，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，代数在35～50代。

1.2 色谱条件色谱柱：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：有机相甲醇(A)，水相0.1%磷酸(B)，A ∶B=3 ∶7等度洗脱；流速，1.00 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL检测波长，273 nm。

1.3 细胞毒性实验采用CCK-8法；计算细胞存活率。

1.4 转运实验取培养21 d、TEER值大于500 Ω·cm-2、碱性磷酸酶与酚红渗透率均达标的Caco-2细胞，进行转运实验。分别测定时间、温度、pH值、P-糖蛋白抑制剂维拉帕米与环孢菌素对没食子酸吸收转运的影响。

1.5 数据处理表观渗透系数( apparent permeability，Papp) 值和外排率(efflux ratio，ER)值。

式中：A为Transwell 小室的有效面积;ΔQ为Δt时间内药物的累积转运量;C0为药物的初始浓度;Papp(BL-AP)为 BL到AP侧的Papp值;Papp(AP-BL)为AP到BL侧的Papp值。

2 结果

2.1 细胞毒性实验如Tab 1，除了250 μmol·L-1外，其余浓度的存活率均超过95%，表明没食子酸对Caco-2细胞没有毒性。

Tab 1 ytotoxicity of gallic acid at different concentrations

2.2 不同时间药物的累积转运量没食子酸的积累随着浓度和时间的增加而增加，呈现出近似线性的关系，说明没食子酸的膜吸收和转运都涉及被动扩散。

2.3 浓度对药物转运的影响吸收的Papp(AP-BL)明显大于排泄Papp(BL-AP)，说明当GA浓度高于一定值时，排泄机制被激活(P<0.05)。

2.4 温度对药物转运的影响4 ℃时，Papp(AP-BL)和Papp(BL-AP)值显著低于37 ℃(P<0.05)，说明温度对没食子酸的吸收有影响。

2.5 pH值对药物转运的影响没食子酸在pH 6.0的Papp(AP-BL)值高于pH 7.4(P<0.05)，说明在pH 6.0时没食子酸的转运比在pH 7.4时更容易。

2.6 P-gp 抑制剂对药物转运的影响与对照组相比，P-gp抑制剂维拉帕米和环孢素A使没食子酸的Papp(AP-BL)值显著升高(P<0.05)，而Papp(BL-AP)值显著降低(P<0.05)，说明没食子酸可能是P-gp的底物。

3 讨论

没食子酸在Caco-2 细胞上的转运方式以被动转运为主。同时没食子酸在 Caco-2细胞的转运受浓度、温度、pH值及P-gp抑制剂的影响，P-gp参与了没食子酸的转运。本研究初步阐明了没食子酸在Caco-2细胞中的转运机制及其影响因素，同时也为没食子酸的进一步开发利用奠定了良好的实验基础。