基于COI基因的橡胶树六点始叶螨遗传多样性分析

聂跃 卢塘飞 陈俊谕 张方平 牛黎明 符悦冠

摘  要：六点始叶螨是橡胶树上的重要害螨之一，具有分布范围广、危害重等特点。为了研究其遗传多样性和遗传分化，本研究利用线粒体COI（mitochondrial cytochrome oxidase subunit I）基因序列对采自海南、云南、越南河内等地区橡胶树上的11个不同地理种群的165头样本进行了种群的遗传多样性分析。获得的六点始叶螨线粒体COI基因片段长度均为658 bp，分析发现可变位点30个，其中简约信息点15个，单变异位点15个，单倍型15种;种群间FST值为0.34698，Nm值为0.47，GST值为0.19660，表明11个种群的六点始叶螨存在一定的遗传分化。

关键词：六点始叶螨;COI;地理种群;遗传分化

中图分类号：S435.76      文献标识码：A

Abstract： Eotetranychus sexmaculatus （Riley） is one of the most important pests of rubber trees， with a wide geographical distribution and heavy infestation. In order to study its genetic diversity and genetic differentiation， the mitochondrial COI gene sequence was used to analyze the genetic structure of 165 individuals from 11 different geographical populations collected from rubber trees in Hainan， Yunnan and Hanoi （Vietnam）. The obtained mitochondrial COI gene fragment of the six-pointed spider mites was 658 bp in length. There were 30 variable sites， including 15 simple information points， 15 single mutation sites， and 15 haplotypes. The FST value between populations was 0.34698， the Nm value was 0.47， and the GST value was 0.19660， indicating that there was genetic differentiation in the 11 populations of E. sexmaculatus （Riley）.

Keywords： Eotetranychus sexmaculatus （Riley）; COI; geographic population; genetic differentiation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.019

六点始叶螨[（Eotetranychus sexmaculatus （Riley））属于叶螨科（Tetranychidae）、始叶螨属（Eotetranychus）。自20世纪70年代首次爆发危害橡胶树以来，该螨已成为我国橡胶树的重要害虫，危害造成叶片变黄、落叶、导致停割降低乳胶产量乃至枝条甚至橡胶树死亡[1-3]。六点始叶螨的寄主范围较广，包括橡胶、柑橘、腰果、番石榴、芒果、菠蘿蜜、油桐、茶树、油梨、苦楝、台湾相思等20多种经济植物[4-6]。六点始叶螨在国内发生范围较为广泛，海南、云南、广东、广西、福建、四川及台湾等省份均有发生[7]，但在不同区域其发生程度存在差异，目前国内外有关该螨不同地理种群是否产生遗传分化未见报道。

近些年来，随着科学技术的发展，DNA条形码被广泛用于研究昆虫的遗传分化，其中mt-DNA 是用于研究分子分类和系统发育的常见基因，已经广泛应用于物种起源和分化以及物种的鉴定和分类等方面的研究[8]。作为分子标记用于研究系统发育手段之一，mt-DNA具有很多优点。线粒体DNA是典型的母系遗传，在细胞分裂时不会发生基因重排，避免了由于遗传方式带来随机性[9-10]。目前关于重要害螨地理种群研究报道十分的丰富。杨顺义等[11]利用线粒体COI基因分析甘肃二斑叶螨Tetranychus urticae地理种群，表明二斑叶螨遗传分化主要来自种群内部，种群间还未发现明显的遗传分化。杨小强[12]利用线粒体COI基因分析马六甲肉食螨地理种群，得到遗传分化主要来自种群间，种群内遗传分化较小。

鉴于六点始叶螨危害的严重性及针对其在不同区域和年份发生程度存在差异等情况，本研究采用线粒体DNA COI基因作为分子标记，从分子遗传学的角度分析橡胶种植区六点始叶螨不同地理种群的种群遗传分化及种内遗传，以明确六点始叶螨是否产生遗传分化，分析不同区域发生原因。

1  材料与方法

1.1  材料

供试虫源：六点始叶螨在2018年9月—2019年6月采自中国海南、云南、广东和越南河内等地区（表1），合计11个地理种群共165头样本。样本采集时，用灭菌的1.5 mL离心管装有95%的酒精临时保存，备用。

试剂和仪器：TAE缓冲液、NP-40、Tween-20、Goldview I型核酸染料，北京索莱宝科技有限公司;20 mg/mL蛋白酶K及PCR相关试剂，宝生物工程（大连）有限公司;DNA Marker，北京全式金生物技术有限公司。聚丙烯酰胺凝胶电泳系统、C1000Touch Thermal Cycler PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.2  方法

1.2.1  总DNA提取  从95%的酒精中将螨虫取出，然后用灭菌去离子的水浸泡2～3 h;配置100 μL缓冲液（86.1 μLddH2O、10 μL10xPCR buffer （Mg?+）、3 μL 20 mg/ml蛋白酶K、0.45 μL NP-40、0.45 μL Tween-20）;将清洗完毕的样品，放到缓冲液中（每个离心管放单头雌成虫），立即用塑料研磨棒研磨，研磨后放置在55 ℃的水浴锅中孵育90 min，95 ℃初始变性10 min，得到的总DNA溶液即可进行PCR反应或者放?20 ℃冰箱保存。

1.2.2  引物和PCR扩增  本研究线粒体COI使用通用引物LEPF1/LEPR1是参考Folmer等[13]引物并修改而来，上游引物为LEPF1：5'-ATTC-AACCAATCATAAAGATATTGG-3'，下游引物为LEPR1：5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAA?TC-3'。引物均由武汉金斯瑞生物科技有限公司合成。线粒体COI基因50 μLPCR反应体系：DNA模板5 μL、2×Gflex Buffer 25 μL、Tks Gflex DNA  Polymerase 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、17 μLddH2O。PCR反应过程：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，44 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，35个循环：最后修复延伸10 min。PCR扩增产物送至广州赛默飞世尔科技有限公司测序。

1.3  数据处理

以11个地理种群165头六点始叶螨的DNA模板进行线粒体基因COI的PCR扩增所得到的DNA序列，Chromas读取序列图，DNAstar去除引物剪切比对序列，并人工核对校正。具有核苷酸多态性的碱基序列，重复测序2次以保证准确性。

运用MEGA7.0软件[14]分析DNA序列的碱基组成，碱基突变位点。采用Kimura-2-parameter模型，用最大似然法（maximum likelihood， ML）构建系统树，采用Bootstrap 1000次检验分子系统树各分支的置信度;应用 Arlequin 3.5软件[15] 计算群体间的分化系数FST（不同种群间的基因分化程度）和基因差异分化系数GST（相对于整个种群的基因分化）;采用DnaSP 5.0[16]统计单倍型数目及出现频率并进行基因流Nm（每代迁入有效个体数）的计算。使用Network 5.0[17]软件绘制基于median-joining的单倍型中介网络图。

2  结果与分析

2.1  线粒体COI基因分析

用引物LEPF1和LEPR1对线粒体DNA COI基因进行扩增，电泳结果见图1。去除引物后序列长度为658 bp，其中ATGC的比例：A%=47.3%;C%=9.8%;G%=12.0%;T%=30.9%。在碱基含量中，可以明显看出A+T的含量明显高于G+C的含量。通过搜索NCBI数据库没有发现高相似度的目的基因，提交DNA序列到NCBI数据库获得登录号为MN338390。

通过软件分析得到，序列中不变位点628个，可变位点（variable sites）30个，占总分析位点4.56%;其中单变异位点（2个变体）[singleton variable sites （two variants）]15个，占总位点数的2.28%，位点分别是25、43、147、359、364、367、419、422、491、525、535、541、571、607、646;简约信息位点（2个变种）[parsimony informative sites （two variants）]14个，位点数为33、38、73、111、116、123、264、299、339、360、522、526、566、613，占總位点数的2.13%;简约信息位点（3个变种）[parsimony informative sites （there variants）]1个，占总位点数的0.15%，位点数是101，具体可变位点分布如图2，可变位点集中在500～600 bp之间。DNA无碱基缺失和替换。

2.2  单倍型、核酸多样性及中性检验

11个不同地区六点始叶螨参数见表2。单倍型多样性（Hd）0.423，方差单倍型多样性0.00501，标准差单倍型多样性0.071。核苷酸多样性（Pi）0.00248，核苷酸平均差异数（K）1.629。说明六点始叶螨整体的遗传多样性水平不高。165头六点始叶螨线粒体COI基因序列共鉴定出15种单倍型（Ha）。其中Hap_1是共享单倍型，每个地理种群都有该单倍型;其中云南江城单倍型最多，有5种分别是Hap_1、Hap_6、Hap_7、Hap_8、Hap_9;儋州、河口、化州、越南河内仅有一种单倍型。

中性检测Tajimas D：?2.32446，当Tajimas D统计值为正值时说明种群进化方式为平衡选择，且有一些单倍型分化;统计值负值时为负向选择，无显著性差异。中性检验表明，11个地理种群六点始叶螨进化方式为负向选择，无显著性差异。

2.3  系统进化和遗传分析

种群间的分化程度主要通过分化系数FST和GST，每代迁入有效个体数基因流Nm衡量。本研究六点始叶螨种群间FST值为0.34698，表明分化程度为显著水平。Nm值为0.47，GST值为0.19660，表明六点始叶螨11个地理种群存在一定的基因交流的同时又存在遗传分化。

以加州钝绥螨（GenBank登录号：AB500?131.1）和神泽氏叶螨（GenBank登录号：AY044644.1）的线粒体COI基因构建六点始叶螨单倍型N-J系统发育树，系统发育树上各分枝的数值经为过1000次bootstrap的置信度，邻近法建树图见图3。构建基于mtDNA COI基因的六点始叶螨不同地理种群单倍型中介网络图，如图4。由图3和图4可得，六点始叶螨单倍型没有明显的分化，只有单倍型Hap-4、Hap-8和Hap-7、Hap-9、Hap-13、Hap-14形成了2个聚类簇，另外单倍型Hap-1为共享单倍型，出现频率最高。

2.4  不同地區地理种群间差异性比较

不同地区间地理种群见表3。各地区间的遗传分化指数FST值在?0.01974～0.75000之间，其中云南瑞丽和海南琼中与其他的地理种群差异性最大，河口和其他地理种群差异性比较小。GST值在?0.03317～1.00000之间。

3  讨论

线粒体DNA是真核细胞中具有母系遗传，比较保守的基因流，是一种研究种和亚种的系统发育以及种群之间关系的分子工具[18]。本研究以线粒体COI基因为工具，研究了海南、云南和越南河内等地区橡胶上11个不同地理种群间六点始叶螨的遗传关系发现：六点始叶螨种群间FST值为0.34698，表明分化程度为显著水平，Nm值为0.47，GST值为0.19660，15种单倍型，表明六点始叶螨11个地理种群存在一定的基因交流的同时又存在遗传分化。

通过分析六点始叶螨不同的地理种群可得：15种单倍型中，海南省只有4种单倍型，云南省有12种单倍型，广东和越南都只有1种共享单倍型，说明云南省单倍型种类十分丰富。另外各个地区之间的遗传分化指数FST值在?0.01974～ 0.75000之间，其中云南瑞丽分化程度很高，可能是这个地区的区域性气候有关，而且瑞丽处于中缅边境，六点始叶螨与境外的种群交流紧密，形成了一定的分化。另外云南省整体遗传分化指数明显高于海南和广东省，原因可能有以下几点：（1）吴蕾等[19]研究认为，叶螨的发育速率受制于温度，发育速率又极大地影响其地理种群的增大，反之超过最适温度，发育历程受到影响，种群数量下降。通过分析发现海南、越南和广东经度不高，基本在20°N左右，在热带地区，云南采样点都在北纬20°N以上，处于不同热带和亚热带边缘，而且橡胶的种植跟经纬度有着密切的联系。

比如：热带和亚热带不同的温度对螨虫发育速率产生影响;可能因为温度原因改变橡胶内部生理生化物质，从而引起螨虫遗传分化。（2）海南、广东、越南都靠近海边，雨水充足，云南在内陆，降雨量有限，然而螨虫对于雨水比较敏感，如果降水量较少，会直接导致螨类数量急剧上升。另外降水量减少，会对螨虫发育产生影响，并遗传给下一代，从而产生遗传分化。（3）都二霞等[20]和徐建祥等[21]发现，紫外线胁迫可以改变螨虫的蛋白质结构和DNA结构，也可以改变寄主植物结构。本研究中云南处于热带和亚热带边缘，光照和紫外线强度都没有海南、越南等地区强烈，这些差异可以改变叶螨的蛋白质结构，或者影响橡胶树光合反应，改变橡胶树物质结构，从而间接影响六点始叶螨系统发育。（4）云南和其他地区种植的橡胶树品种存在差别，其品种通常抗寒性更强，由于寄主品种的差异从而影响了六点始叶螨的发育。综上所述，六点始叶螨遗传分化不仅跟地理距离有关系，跟温度、湿度、光照等外部环境有着密切的联系。比如：2019年4—6月云南发生旱灾，导致云南主要的橡胶种植区螨虫大爆发。由此可见，温度和湿度对于螨虫的数量和发育有着密切的联系。

蜱螨个体较小，相似种外表和体色差异无法从形态上分辨，因此研究者引用线粒体COI基因，作为蜱螨分类的重要辅助手段。例如：邓洁等[22]利用线粒体COI基因鉴定印度新曲厉螨。通过比较六点始叶螨的线粒体COI基因和NCBI数据库其他螨虫的基因发现：六点始叶螨最高相似度是叶螨科COI基因只有92.69%（提交数据库后登录号MN338390），与其他的叶螨科螨类差异性较大，可以作为种间鉴定分析的DNA条形码，用于快速鉴定。另外，本研究还存在很多的不足，比如采集样本点较少，并且各采样点之间的分布不均匀，同时本研究仅选用了线粒体COI基因，并不能完全反映出六点始叶螨的遗传分化多样性，还需将本研究结合DNA序列分析方法与SSR、ISSR标记法相互结合进行更加深入的探讨。

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