蛇床子素对卵巢组织氧化应激损伤的作用

卢晓声 吴昊 习海涛 黄朝霞 吕杰强

[摘要] 目的 探討蛇床子素（OST）对卵巢氧化损伤的保护作用。 方法 体外培养小鼠卵巢组织，用过氧化氢（H2O2）构建卵巢组织氧化损伤模型（模型组）;药物组以20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL 3种不同浓度OST预处理卵巢组织后再加入H2O2;同时设对照组。在显微镜下计数卵巢组织内卵泡总数和生长卵泡数，计算生长卵泡率;化学发光法检测培养液中雌二醇（E2）的水平，WST-1法检测卵巢组织中SOD活性，TBA法检测卵巢组织中MDA含量。结果 与对照组相比，H2O2损伤模型组卵巢生长卵泡数、卵泡总数和生长卵泡率均明显下降，培养第4天的培养液中E2浓度明显下降，组织内SOD活性显著下降（P<0.01），MDA含量明显升高（P<0.01）。40 μg/mL和80 μg/mL两个浓度的OST预处理后，卵巢组织中的生长卵泡数、卵泡总数和生长卵泡率、第4天培养液中的E2浓度、组织内SOD活性均较模型组有不同程度的上升，MDA含量下降（P<0.01）。20 μg/mL OST组仅在第4天培养液中的E2浓度上明显高于模型组，其他相关指标相对于模型组均无显著性差异。 结论 一定浓度的蛇床子素预处理可减轻H2O2对卵巢组织的氧化应激损伤。

[关键词] 蛇床子素;过氧化氢;氧化损伤;卵巢

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）16-0035-05

Effects of Osthole on oxidative stress in ovarian tissue

LU Xiaosheng   WU Hao   XI Haitao   HUANG Zhaoxia   LV Jieqiang

Reproductive Center， the 2nd Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325000， China

[Abstract] Objective To explore the protective effect of Osthole（OST） on ovarian oxidative damage. Methods Mice ovarian tissues were cultured in vitro. Hydrogen peroxide（H2O2） was used to construct oxidative damage models of ovarian tissues（model group）. The drug group was pretreated with different concentrations of OST， 20 μg/mL， 40 μg/mL and 80 μg/mL and H2O2 was added later; the control group was also set. The total number of follicles and the number of growing follicles in the ovarian tissue under a microscope was counted to calculate the rate of growing follicles; chemiluminescence method was applied to detect the level of estradiol（E2） in the culture fluid， WST-1 method to detect SOD activity in the ovarian tissue， and TBA method to detect the MDA content in ovarian tissue. Results Compared with the control group， the number of ovarian growth follicles， the total number of follicles， and the growth follicle rate in the H2O2 injury model group significantly reduced. The concentration of E2 in the culture fluid on the 4th day of culture significantly reduced， the SOD activity in the tissues significantly reduced（P<0.01）， and MDA content increased significantly（P<0.01）. After pretreatment with OST at 40 μg/mL and 80 μg/mL， the number of growing follicle in the ovarian tissue， the total number of follicles and the rate of growing follicles， the concentration of E2 in the culture medium on the 4th day， and the SOD activity in the tissues increased and MDA contents decreased as compared with the model group（P<0.01）. The E2 concentration of in the culture medium in 20 μg/mL OST group was significantly higher than that in the model group on the 4th day， and there were no significant differences in other related indicators compared with the model group. Conclusion Pretreatment with a certain concentration of OST can reduce the oxidative stress damage of ovarian tissue by H2O2.

三种不同浓度的OST组间比较，40 μg/mL和80 μg/mL两组在生长卵泡数上均明显高于20 μg/mL组（P<0.01），而40 μg/mL和80 μg/mL两组之间无统计学差异;3个不同浓度的OST组在卵泡总数上，组间均有统计学差异，以80 μg/mL组最高，20 μg/mL组最低（P<0.05）;3组之间在生长卵泡率上均无统计学差异（P>0.05），见表1、图1。以上结果提示20 μg/mL OST组的预处理不足以对H2O2在卵巢组织中造成的卵泡发育和构成上的损伤产生预防或缓解的作用，40 μg/mL OST组在卵泡数量与生长卵泡的比例上，较20 μg/mL OST组已有较大改善，而80 μg/mL OST组的浓度在本研究中对改善卵泡的总数和生长卵泡的比例均是最佳。

2.2 蛇床子素对体外培养卵巢E2分泌的影响

检测培养2 d收集的培养液中E2浓度，5组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）;提示H2O2在培养的第2天尚未对卵巢的内分泌功能产生影响。

培养第4天，模型组在H2O2的作用下，培养液中E2的浓度明显下降，明显低于对照组（P<0.01），提示H2O2在培养第4天对卵巢的内分泌功能产生破坏;而3个不同浓度的OST组培养第4天的培养液E2浓度显著高于模型组（P<0.01），且与对照组相比无显著性差异。提示OST的预处理，可减缓H2O2对卵巢内分泌功能的影响。3个OST组之间比较亦无显著性差异（P>0.05），提示OST在较低浓度即可缓解H2O2对卵巢内分泌功能的影响，见表2、图2。

2.3 蛇床子素对卵巢组织内SOD活性的影响

SOD的活性检测结果显示，模型组在H2O2的作用下，SOD活性较对照组明显降低（P<0.01）;3个OST组的SOD活性均明显低于对照组（P<0.01）。20 μg/mL OST组的SOD活性与模型组比较无显著性差异，40 μg/mL OST组和80 μg/mL OST组的SOD活性较模型组显著提升（P<0.01）。OST组间比较，40 μg/mL OST组和80 μg/mL OST组的SOD活性均高于20 μg/mL OST组，两者之间无显著性差异。见表3、图3。

以上结果提示：H2O2对卵巢组织中的SOD活性有明显影响，20 μg/mL 浓度的OST不足以缓解H2O2对卵巢组织中SOD活性的损伤，40 μg/mL OST组和80 μg/mL OST组两个浓度对SOD活性有所改善，但也未能恢复到对照组的水平。

2.4 蛇床子素对卵巢组织内MDA 含量的影响

MDA的含量检测结果显示，模型组在H2O2的作用下，MDA含量较对照组明显升高（P<0.01）;20 μg/mL OST组和40 μg/mL OST组的MDA含量显著高于对照组（P<0.01）;80 μg/mL OST组的MDA含量则与对照组无显著性差异（P>0.05）;20 μg/mL OST组的MDA含量与模型组比较无显著性差异，40 μg/mL OST组的MDA含量较模型组显著降低（P<0.01），80 μg/mL OST组的MDA含量显著低于模型组（P<0.01），3个不同浓度的OST组间比较，MDA含量均有显著性差异，以20 μg/mL OST组最高，80 μg/mL OST组最低（P<0.05）。见表3、图3。

以上结果提示：H2O2对卵巢组织中的MDA含量有明显影响，20 μg/mL 浓度的OST不足以缓解H2O2对卵巢组织中MDA含量的影响，40 μg/mL浓度的OST已开始表现出缓解H2O2损伤的趋势，而80 μg/mL的OST则可使卵巢组织中的MDA含量恢复到对照组的水平，呈现了浓度效应相关的趋势。

3 讨论

卵巢储备功能下降（Diminished ovarian reverse，DOR）主要表现为卵子数量的减少和质量的减退，患者妊娠率低，行辅助生殖技术的治疗效果也较差[7]，给患者及其家庭造成身体上的痛苦和经济上的負担。如何减缓卵巢功能衰退的速度，保护卵巢功能，提高生活质量，是目前国内外生殖医学界亟待解决的问题。

在祖国的传统中医学中，没有DOR这一诊断，依据其临床表现，可归属于“血枯”、“经水早断”等范畴[8]。中药蛇床子在治疗女性肾虚血枯、宫冷不孕中有独特的功效。蛇床子是为伞形科植物蛇床的干燥成熟果实[9]。《本草纲目》中记载蛇床子“乃右肾命门、少阳，三焦气分之药;神农列之为上品，不独补助男子，而又有益妇人”、“暖丈夫阳气，助女人阴气”;《别录》中描述蛇床子“温中下气，令妇人脏热，男子阴强，令人有子”。从蛇床子中提取的OST，是蛇床子中的主要功能成分，又名甲氧基欧芹酚，具有显著的抗炎[10]、抗肿瘤[11]和抗氧化[12]等作用，临床上广泛用于男科、妇科、皮肤科疾病等的治疗。

本研究利用OST对H2O2引起的卵巢组织氧化损伤模型进行干预，研究OST在卵巢组织抗氧化应激中的治疗作用并初步探索了其机制。研究发现，H2O2对卵巢组织造成了氧化应激损伤，导致小鼠卵巢内的卵泡总数、生长卵泡数、生长卵泡率均明显减少，培养第4天分泌的E2水平降低。在使用OST预处理后，40 μg/mL OST与80 μg/mL两个浓度的OST可使H2O2作用下卵巢内的卵泡总数、生长卵泡数、生长卵泡率较模型组明显提高。OST预处理的3组，对培养2天的卵巢组织分泌的E2水平没有改善，但在培养第4天，观察到有OST预处理的卵巢组织分泌的E2水平比模型组有明显的改善;在抗氧化应激能力的检测中，40 μg/mL OST组与80 μg/mL OST组两个浓度的OST预处理可减轻H2O2引起的卵巢组织氧化损伤，表现为SOD水平的回升和MDA含量的下降。以上结果提示，一定浓度的OST预处理可减轻H2O2引起的卵巢组织损伤，其机制可能与氧化应激通路有关。

大量研究表明，氧化应激损伤是导致卵巢衰老的重要原因，DOR的发生发展与氧化应激损伤密切相关[13]。卵巢组织内自由基生成持续增多和清除能力不断下降，导致氧化应激压力持续上升，进而诱发一系列的衰老性改变[14]：影响卵母细胞的发育、成熟、卵泡闭锁，增加窦卵泡的凋亡，影响卵母细胞的质量、受精和胚胎着床，最终降低女性的生育力[15]。而应用抗氧化剂，则可改善卵母细胞数目及质量降低的现象，降低胚胎非整倍体的发生率[2]。本研究测定离体培养的小鼠卵巢组织内的两种氧化应激重要相关因子SOD和MDA，以评估OST在卵巢组织中的抗氧化应激作用，并初探其改善卵巢储备功能的可能机制。

SOD是在生物体内广泛存在的一种抗氧化物歧化酶，其能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用[16]。在卵巢衰老过程中，SOD的表达与活性均呈现不同程度的下降[17-18]。在本研究中发现，H2O2诱导的氧化应激损伤使卵巢组织内的SOD活性显著降低，40 μg/mL OST与80 μg/mL OST两个浓度均能明显改善H2O2对SOD活性的损伤。

MDA是脂质过氧化反应的产物，可反映生物体内脂质过氧化反应的程度，是评估氧化应激损伤的一个重要指标[19]。在男科研究中，蛇床子素可明显降低受损精子中MDA的水平[20]。在本研究中，H2O2导致的氧化损伤使卵巢组织内的MDA显著升高。而在不同浓度OST处理后，40 μg/mL OST组与80 μg/mL OST组的MDA含量较模型组显著下降，并与OST剂量呈一定的相关性。20 μg/mL的OST在本研究中未能显示有效的抗H2O2氧化应激损伤作用。

综上，一定浓度的蛇床子素在卵巢组织中具有缓解H2O2引起的氧化应激损伤的作用，在氧化应激压力下，保护卵巢组织的功能，增强卵巢组织的抗氧化能力，OST在卵巢功能保护中的作用值得进一步研究。

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（收稿日期：2019-11-29）