花椰菜黑腐病苗期抗性鉴定方法研究

姚玉荣 霍建飞 郝永娟 贲海燕 王万立

摘要 为建立快速、高效的花椰菜黑腐病苗期抗性鉴定技术，以黑腐病病原 Xanthomonas campestris pv. campestiss为 菌源，高感黑腐病的花椰菜品种Y1-2为试验材料，研究了接种菌液浓度、苗龄、接种方法以及发病温度等因素对抗病性鉴定的影响，建立了优化的花椰菜黑腐病人工接种方法。结果表明， 抗病性接种适宜条件为接种菌液浓度为1×108CFU/mL，接种时期为4～5叶期，喷雾法接种，发病温度28 ℃。该方法鉴定结果能够客观反映花椰菜品种的抗病性。

关键词 花椰菜; 黑腐病;抗性鉴定

中图分类号 S436.3 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）14-0137-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.038

Abstract In order to develop a rapid and efficient technique for evaluation of resistance to black rot by using artificial inoculation with the pathogenic Xanthomonas campestris pv. campestiss and the cauliflower variety Y1-2， the effects of inoculation concentration， seedling age， inoculation method and temperature were studied. The optimizing artificial inoculation methods for black rot identification were set up. The results showed that the key procedure was praying inoculum liquor of 1×108 CFU/mL on seedling with 4-5 true leaves stage keeping at 28 ℃. The identification results of the established assessment system can objectively and effectively reflect the resistance of cauliflower.

Key words Brassica oleracea var. botrytis; Black rot;Resistance identification

十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单孢菌野油菜致病变种 Xanthomonas campestris pv. campestiss （Pam.） Down引起的一种世界性重要病害[1-2]。20世纪50年代末在华北地区发生[3]，80年代在全国各地普遍流行，极大威胁着十字花科蔬菜的生产，严重时减产70%[4]。种子带菌是黑腐病的主要侵染源和重要传播方式，其带菌率达0.03%就能造成生产上黑腐病暴发[5]。生产上黑腐病的防治方法主要包括化學药剂防治，农事操作如轮作、清楚病残体等，但最经济、有效的防治措施为选育抗病品种。

苗期人工接种是筛选抗病品种和种质资源创新的前提条件。不同作物抗病性鉴定方法不同。研究发现，萝卜、甘蓝黑腐病鉴定时接种浓度为1×108CFU/mL时利于发病[6];大白菜黑腐病抗病鉴定接种物最佳浓度为3.0×108CFU/mL[7]。不同作物接种最佳苗龄不同，萝卜接种最佳苗龄为5～6叶期[8]，甘蓝最佳苗龄为4～6叶期[9]。近年来，随着我国菜田复种指数提高，花椰菜黑腐病的发病程度和发病率呈上升趋势，筛选花椰菜黑腐病抗源十分必要，但关于花椰菜黑腐病抗病性鉴定方法尚未见系统报道。

笔者以天津地区花椰菜主产区致病力强的黑腐病病菌 Xanthomonas campestris pv. campestiss为 菌源，以天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所高感黑腐病品种Y1-2为试验材料，研究了接种浓度、苗龄、接种方法以及发病温度对抗病性鉴定的影响，建立了优化的花椰菜黑腐病苗期接种鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试菌株：黑腐病菌野油菜黄单孢菌野油菜致病变种（ Xanthomonas campestris pv. campestiss， 简称Xcc）由天津市植物保护研究所蔬菜病害实验室分离保存。

供试品种：花椰菜高代纯合自交系Y1-2（高感）、EC-247（抗病）、EC-455（抗病）、EC-464（抗病），由天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所提供。

将供试花椰菜种子在50 ℃热水中处理10 min，播种于育苗穴盘内。育苗基质为蛭石∶草炭∶土壤=1∶1∶2，灭菌后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 抗病鉴定方法。

抗病鉴定方法参考《中国主要蔬菜抗病育种》[10]，并加以改进。

病情指数 =（发病叶数×相应病级数）/（调查总叶数×9）×100

病情分级标准：0 级.无病症; 1级.叶片有黑色枯死点，无扩展; 3 级.病斑向外扩展，占叶面积 5%以下;5级.病斑向外扩展，占叶面积5%～25%;7 级.病斑向外扩展，占叶面积25%～50%;9 级.病斑向外扩展，占叶面积50%以上。

抗病性标准：免疫（I）.病情指数为0;高抗（HR）.0<病情指数≤11.11;抗病（R）.11.11<病情指数≤33.33;耐病（T）.33.33<病情指数≤55.55;感病（S）.55.55<病情指数≤67.77;高感（HS）.67.77<病情指数≤100。

1.2.2 不同接种菌液浓度。将培养24 h的菌液浓度调节至1×106、1×108、×1010CFU/mL 3个浓度。

1.2.3 不同接种寄主苗龄。接种苗龄为2～3叶期、4～5叶期、6～7叶期、8～9叶期，接种菌液浓度为1×108 CFU/mL。

1.2.4 不同接种方法。

花椰菜黑腐病主要通过伤口和水孔侵入，参照李永镐等[11]的方法并略有改进，采用剪叶、喷雾法进行比较。剪叶法：用灭菌的医用剪刀沾取接种物在完全展开的叶片尖端 垂直于主脉的方向剪掉 0.5～1.0 cm ，每剪1次沾取1次菌液;喷雾法：用小型喷雾器将接种物喷洒到植株上。2种接种方法在接种前后保湿24 h。

1.2.5 不同发病温度。采用“1.2.1”确定的最佳菌液浓度，采用喷雾法接种于4～5叶期的花椰菜幼苗上，温度设置为24、26、28、30 ℃。

1.3 花椰菜苗期抗病鉴定技术的验证

将建立的人工接种鉴定技术对已知抗性的5个花椰菜品种进行苗期抗性鉴定，设置3次重复，每个重复10株，对等量的无菌水作空白对照。

1.4 数据分析 试验数据采用Microsoft office Excel 2010分析，统计分析采用SPSS 21软件，采用Duncans新复极差法（ P <0.05）进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同接种菌液浓度对接种效果的影响

不同接种菌液浓度下，花椰菜幼苗黑腐病发病率病情指数随着菌液浓度增加而增大，各处理间差异显著（表1）。其中接种菌液浓度为1×108CFU/mL时，发病率为82.14%，病情指数为69.21，能够真实反映出花椰菜Y1-2本身抗性，菌液浓度为1×106CFU/mL 时，发病较轻，品种表现为抗性，不能真实反映植株本身的抗性;菌液浓度为1×1010CFU/mL时，发病率达93.33%，病情指数为83.78，发病严重，不能体现品种的真实抗性。菌液接种浓度1×108CFU/mL为最佳接种浓度。

2.2 不同接种寄主苗龄对接种效果的影响 4个苗龄试验中2～3叶期接种时，由于幼苗较小，接种后发病面积较大，发病严重，平均发病率达96.34%，病情指数为85.53（表2）。苗龄为4～5叶期发病率为75.00%，病情指数为68.51，适合用于苗期接种。苗龄6～7叶及8～9叶，幼苗较大，抗性增强，病情指数为50.91和31.35，抗性水平表现为耐病和抗性，不能真实反映品种抗性。因此4～5叶期的苗龄适合花椰菜苗期抗黑腐病接种鉴定。

2.3 不同接种方法对接种效果的影响

剪叶法接种较喷雾法接种发病快，剪叶法接种2 d开始发病，而喷雾法第4天开始发病。接种10 d后调查，剪叶法和喷雾法接种的发病率为100%和81.61%，病指指数为85.37和67.93（表3），2種方法均可用于花椰菜苗期接种鉴定，但由于喷雾法操作快捷，因此选择喷雾法进行花椰菜苗期黑腐病接种鉴定。

2.4 不同发病温度对接种效果的影响

由表4可知，处理温度为24 ℃时，花椰菜Y1-2表现为抗性，温度为26 ℃时，表现为感病，这2个温度均不能表现出品种的真正抗性，不能用于苗期抗病性鉴定。温度为28和30 ℃时均表现为高感，但30 ℃时，植株几乎全部死亡，无法计算病情指数。适宜花椰菜苗期黑腐病抗病性鉴定的温度为28 ℃。

2.5 花椰菜苗期抗性鉴定技术的验证

根据上述结果对已知抗性的5份品种进行接种鉴定。结果显示，5份品种抗性表现与已知抗性相符，该试验建立的花椰菜苗期抗性鉴定技术能够客观反映试验材料的抗性水平（表5）。

3 结论与讨论

该试验结果表明，在一定范围随着接种菌物浓度的提高，黑腐病发病率和病情指数增加，最佳接种浓度为1×108CFU/mL，这与李永镐等[11]的甘蓝黑腐病苗期接种浓度结果一致。苗龄比较结果显示，4～5叶期适宜苗期接种，苗龄小发病重，苗龄大植株本身抗性增强，均无法体现品种真实抗性。喷雾接种法是国内外最普遍采用的接种方法，Bandyopadhyay等[12]认为黑腐病作用位点为水孔。喷雾接种后病原菌在水孔处扩展蔓延，能够全面反映寄主的抗病性，而且该方法具有简单、快捷、高效等特点，适合花椰菜黑腐病的抗性鉴定。龚静等[13]采用喷雾方法对38个甘蓝品种进行抗病性鉴定，结果显示该方法能够准确区分抗感材料。研究发现随着温度升高，花椰菜对黑腐病的抗性降低，与甘蓝及大白菜对黑腐病的研究结果相一致[14-15]。

该研究建立和优化了花椰菜黑腐病苗期抗病性鉴定方法，即喷雾法接种，菌液浓度1×108CFU/mL，苗龄4～5叶期，发病温度28 ℃，接种7 d后调查发病情况。该方法鉴定结果准确，能够客观反映花椰菜品种的抗性。植物对病害的抗病性表现受多方面因素的影响，全面准确鉴定不同品种抗黑腐病的表现，仍需要进一步研究。

参考文献

[1]WILLIAMS P H，STAUB T，SUTTON J C.Inheritance of resistance in cabbage to black rot[J]. Phytopathology， 1972， 62：247-252.