解淀粉芽孢杆菌JL-B05生物学特性及生理生化指标测定

袁宗胜 刘芳 穆景利 周丽丽 黄贞胜 林静 谢宝贵

摘要 [目的]研究解淀粉芽孢杆菌JL-B05的生物学特性及生理生化指标。[方法]对解淀粉芽孢杆菌JL-B05进行平板培养，并对菌体进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色，获得解淀粉芽孢杆菌JL-B05的培养特征和形态特征;采用温度梯度和pH梯度法测定解淀粉芽孢杆菌JL-B05的最适培养条件，绘制其40 h内的生长曲线，并对其生理生化指标进行测定。[结果]解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌落颜色为白色，菌落边缘不平整，菌体呈杆状，革兰氏阳性，有芽孢，无荚膜;解淀粉芽孢杆菌JL-B05最适培养温度为25 ℃，最佳生长pH为7。[结论]对解淀粉芽孢杆菌JL-B05进行生物学特性及生理生化指标的测定，为后续系统研究解淀粉芽孢杆菌JL-B05及生产复合微生物菌剂奠定基础。

关键词 解淀粉芽孢杆菌;生物学特性;最适培养条件;生理生化指标

中图分类号 Q93 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）14-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.001

Abstract [Objective]To study the biological characteristics and physiological & biochemical indexes of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05.[Method]The culture characteristics and morphology characteristics of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05 were obtained by plate culture，Gram staining，spore staining and capsule staining，and the optimum culture conditions of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05 were determined by temperature gradient and pH gradient method，the growth curves of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05 were plotted within 40 hours，and their physiological & biochemical indexes were determined.[Result]The colony color of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05 was white，the colony edge was uneven，the bacteria were rod-shaped，Gram-positive，there were spores and no capsule.The optimum culture temperature of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05 was 25 ℃，the optimum growth pH was 7.[Conclusion]The biological characteristics and physiological & biochemical indexes of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05 were determined，which laid the foundation for the subsequent systematic study of Bacillus amyloliquefaciens JL-B05 and the production of compound microbial agents.

Key words Bacillus amyloliquefaciens; Biological characteristics;Optimal culture conditions;Physiological & biochemical indexes

植物內生细菌指其生活史的一定阶段或全部阶段均生活在健康植物的各种组织和器官内部，并且与植物建立了和谐联合关系的细菌[1]。内生细菌通过自身产生代谢产物或借助信号转导对宿主植物生长发育产生重要影响，主要在促进宿主植物生长、增强宿主植物抗性及提高植物修复能力等方面[2-6]，如 Microbacterium 具有促进植物生长的作用[7]， Bacillus具有良好的生防潜力[8]，Sphingomonas 对植物自我修复功能[9]等。笔者选用从毛竹体内分离并筛选出的具有促生、拮抗功能的解淀粉芽孢杆菌JL-B05[10]，研究其生物学特性，即最适生长温度、最适pH、生长曲线及其生理生化指标，为内生解淀粉芽孢杆菌JL-B05的应用及其复合微生物菌剂的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 解淀粉芽孢杆菌JL-B05，由福建农业大学菌物研究中心筛选出的具有较好促生、拮抗效果的内生细菌。

1.2 培养基

1.2.1 NA培养基。内生菌培养采用NA培养基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2 （液体培养基则不加琼脂）。

1.2.2 淀粉水解培养基。蛋白栋 5.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏 3.0 g，可溶性淀粉 2.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.2。

1.2.3 产H2S试验培养基。蛋白胨 10.0 g，酵母浸膏 3.0 g，牛肉膏 3.0 g， FeSO4 0.2 g，硫代硫酸钠 0.3 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.4。

1.2.4 葡萄糖发酵试验培养基。牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 3.0 g，K2HPO4 2.0 g，2.0%溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL，葡萄糖 5.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.4。

1.2.5 硝酸盐还原试验培养基。蛋白胨 10.0 g，NaNO3 1.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.6。

1.2.6 柠檬酸盐试验培养基。柠檬酸钠 5.0 g，NaCl 5.0 g，MgSO4 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，（NH4）H2PO4 1.0 g，瓊脂 20.0 g，1%溴百里酚兰液 8 mL，蒸馏水 1 000 mL， pH 6.8。

1.2.7 丙二酸利用试验培养基。酵母浸膏 1.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，K2HPO4 0.6 g，KH2PO4 0.4 g，NaCl 2.0 g，丙二酸钠 3.0 g，1%溴百里酚兰液 3 mL，蒸馏水 1 000 mL，pH 6.8。

1.2.8 V-P试验及甲基红培养基。蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，磷酸二氢钾5.0 g;蒸馏水 1 000 mL，pH 7.2。

1.2.9 硝酸盐还原试验培养基。蛋白胨5.0 g，酵母膏3.0 g，硝酸钾1.0 g，琼脂粉7.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0～7.2;

1.2.10 吲哚试验培养基。胰蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2.11 石蕊牛乳培养基。新鲜的脱脂牛乳100 mL加入2.5% 石蕊水溶液至淡紫色（约4 mL）。

1.3 主要试剂 HCl溶液、NaOH溶液、碘液、95%乙醇、番红液、草酸结晶紫、5%孔雀绿染色液、1%醋酸结晶紫、20% CuSO4水溶液。所用试剂均为国产分析纯。

1.4 解淀粉芽孢杆菌JL-B05生物学特性研究

1.4.1 解淀粉芽孢杆菌JL-B05的培养特征和形态特征。

取供试解淀粉芽孢杆菌JL-B05接种于NA平板培养基上，28 ℃培养2～3 d，观察菌落颜色和形态，包括菌体形状和芽孢形态等重要鉴别特征。对菌体进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，在显微镜下观察染色结果，细菌形态观察方法参照东秀珠等[11]、方中达[12]。

1.4.2 温度对解淀粉芽孢杆菌JL-B05生长的影响。在洁净试管中加入10 mL NB液体培养基，灭菌冷却后将解淀粉芽孢杆菌JL-B05 按1%接种量接种于液体培养基试管中，分别置于15、20、25、30、35、40 ℃ 6个温度梯度下、180 r/min 振荡培养24 h，以不接种解淀粉芽孢杆菌JL-B05的NB液体培养基作为对照，每个处理3个重复，测定 OD600值，以确定其生长的最适温度。

1.4.3 pH对解淀粉芽孢杆菌JL-B05生长的影响。在洁净试管中加入10 mL NB液体培养基，用 1 mol/L HCl 或 1 mol/L NaOH 调整液体培养基的初始pH，使培养基pH梯度为 3、4、5、6、7、8、9、10，并且每个处理3个重复，接种解淀粉芽孢杆菌JL-B05，30 ℃下180 r/min，振荡培养24 h，测定OD600，以确定其生长的最适pH。

1.4.4 培养时间对解淀粉芽孢杆菌JL-B05生长的影响。在洁净试管中加入10 mL NB液体培养基，灭菌冷却后，按1%的接种量接种解淀粉芽孢杆菌JL-B05，30 ℃下 180 r/min，振荡培养。以开始放摇床振荡培养进行第一次取样，测量其OD600值。以后按每 2 h定时取样，测定菌液的 OD600值。

1.5 解淀粉芽孢杆菌JL-B16生理生化指标的测定

解淀粉芽孢杆菌JL-B05生理生化指标测定的项目主要有接触酶、氧化酶、厌氧生长、V-P、明胶液化、甲基红、柠檬酸盐、硝酸盐还原、7%NaCl生长、淀粉水解等。测定方法参照东秀珠等[11]。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌JL-B05生物学特性分析

2.1.1 解淀粉芽孢杆菌JL-B05培养特征和形态特征。

取供试解淀粉芽孢杆菌JL-B05接种于NA平板培养基上，28 ℃培养3 d，观察菌落颜色为白色，菌落边缘不平整，通过显微镜观察菌体呈杆状。对菌体进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，结果显示解淀粉芽孢杆菌JL-B05为革兰氏染色阳性，有芽孢，无荚膜。

2.1.2 温度对解淀粉芽孢杆菌JL-B05生长的影响。

从图1可以看出，解淀粉芽孢杆菌JL-B05随着培养温度的逐步升高OD600值也逐步升高，培养温度达25 ℃时OD600值最大。在25～30 ℃时，随着培养温度的增加OD600值呈下降趋势，在35～40 ℃时OD600值呈稳定并逐步下降的趋势。由此可见，解淀粉芽孢杆菌JL-B05 的最适生长温度为25 ℃。

2.1.3 pH对解淀粉芽孢杆菌JL-B05生长的影响。从图2可以看出，随着pH的升高，解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌液的OD600值逐步升高，待pH为7时达到最高值，随后OD600随pH的增加呈下降趋势。即最佳生长pH为7。