利用高效的大片段DNA回收方法改良Fosmid文库的构建

张翠翠 赵胜 王越， 张鹏， 常玉晓

（1. 广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004；2. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所，深圳 518120）

基因组Fosmid文库技术自1992年被创建之后，即广泛地应用于基因组学研究当中［1-12］。1996年，Preston等［13］利用Fosmid文库识别并鉴定了寄生在海绵中的一种嗜冷泉古菌（Cenarchaeum symbiosum）。1997年，Fitz-Gibbon等［14］利用Fosmid文库构建了一种超嗜热古细菌（Pyrobaculum aerophilum）的物理图谱，并预测了其基因组含474个基因。1998年，Deckert等［15］用“鸟枪”测序法破解超嗜热菌（Aquifex aeolicus）的基因组时，借助Fosmid文库来填补重叠群之间的空缺。1999年，Cui等［16］构建两个自交不亲和油菜株系的Fosmid文库，通过对文库中的部分克隆测序，对控制芸苔属植物的自交不亲和性的S位点区间进行了结构和转录分析。2004年，国际人类基因组测序联合会公布的已完成测序的人类基因组有341个空缺，包括位于常染色质区域的250个空缺，Bovee等［17］利用Fosmid文库将常染色质区域的26个空缺补全，67个空缺平均每个都填补约32 kb。

新一代测序技术，尤其是读长可达20 kb甚至40 kb以上的单分子测序技术的不断进步，使Fosmid文库的应用日渐式微。但是，Fosmid文库在当前的基因组学研究中仍然具有其独特的价值。第一，与细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）文库类似，Fosmid文库可以用于基因图位克隆过程中目标区域序列的精确测序。目前，虽然有很多物种都已经有了参考基因组序列，但同一物种不同品种之间的基因组序列通常存在很大差异［18］。这导致在图位克隆基因的过程中，将基因精细定位后，有时难以根据参考基因组序列获得目标区段的准确序列。此时，需要构建BAC或Fosmid文库，并从中筛选位于目标区域的克隆进行测序，从而获得候选基因的准确序列。例如，2016年，Zhao等［19］在通过图位克隆法鉴定水稻褐飞虱抗性基因BPH9时，利用Fosmid文库确定了抗性亲本Pokkali定位区间的68 kb DNA序列，从而确认了候选基因并获得其准确序列，这样的例子还有很多，如小麦条锈病抗性基因Yr28的克隆等［20］。第二，虽然测序技术已经取得了相当大的发展，但在全基因组测序的过程中，仍然经常使用Fosmid文库辅助组装或者验证基因组组装的准确度。例如，2014年，松树和甜菜的基因组组装研究者都借助了Fosmid文库［21-22］。2017年，在水稻蜀恢498基因组的组装过程中，研究者利用来自564个Fosmid混合池（池容量为1 000-1 500个单克隆）的简化基因组测序数据，将来自于全基因组的PacBio reads互相区分并分别组装，用于降低基因组组装的复杂度，开创了Fosmid文库在基因组组装中的应用新方向［18］。此外，Fosmid文库还被用于人类基因组的单倍型组装［23］。2019年，在糜子的全基因组测序中，研究者利用Fosmid文库单克隆测序验证基因组组装的准确度［24］。第三，在宏基因组学的研究中，Fosmid文库也可以被用来保存环境样本中所包含的全部微生物的基因组DNA，并用于后续的基因功能分析［25-26］。

Fosmid载体由cosmid载体发展而来，最初是Kim等［27］将带有大肠杆菌致育（Fertility，F）因子的pBAC载体与Cosmid载体pUCcos融合后构建成pFOS1载体。Cosmid载体是一种最老的高容量载体，可插入28-45 kb的外源DNA；应用Cosmid载体构建基因组文库时，选择28-45 kb的DNA片段与载体连接，可保证包装后的DNA高效进入λ噬菌体头部，从而提高建库效率［28］。在连接过程中，样品的DNA小片段之间可能相互连接，之后再与载体连接，从而产生包含来自两个或两个以上不相邻基因组区段的嵌合克隆［28］。另外，由于大肠杆菌携带的重组子拷贝数很高，黏粒中克隆的DNA会发生重排［28］。Kim等［27］将F因子引入Cosmid载体构成Fosmid载体，保证了构建的重组质粒DNA在每个细胞中只有1-2个分子，从而极大降低了克隆中外源DNA的重排水平。若要减少Fosmid文库中嵌合克隆的数量，可在建库时尽量降低连接反应中小片段DNA的含量。因此，对外源DNA片段大小进行准确地筛选，可排除小片段DNA从而减少嵌合克隆；同时，排除超过45 kb的大片段DNA，可以提高文库的制备效率。在Fosmid文库构建试剂盒（Epicentre，美国）的使用说明中，建议外源DNA片段大小为40 kb左右。但是，从琼脂糖凝胶中回收、纯化长度超过20 kb的DNA片段是分子生物学实验的一个难点，且长度越长，回收效率越低。因此，准确、高效的回收40 kb的DNA片段是Fosmid文库构建的一个重要且难度较高的步骤。

当前，虽然有多种方法可以用于分离40 kb范围内的DNA片段，包括磁珠、硅胶膜（Silica membrane）或硅胶颗粒（Silica particles）以及密度梯度离心，但是它们的回收效率都较低。综合比较不同方法，传统的切胶并电洗脱至透析袋，仍然是回收40 kb DNA的最好方法［28］。2015年，Sage Science公司开发出了SageELF仪器，将传统的切胶并利用透析袋回收DNA的过程自动化，不仅简化了利用透析袋回收DNA的操作流程，也提高了DNA的回收效率。目前，在新一代测序领域，Sage ELF已经被广泛应用于不同长度的DNA片段回收［29］，如100 bp的miRNA文库、400 bp左右的Truseq文库、10 kb左右的Mate pair文库和1-5 kb的PacBio iso-Seq文库。但是，Sage ELF仪器中并未设置回收40 kb的方法。

本研究利用SageELF提供的0.75%琼脂糖胶盒，尝试将其内置的回收10 kb DNA的程序，改造成回收40 kb DNA的程序。我们对这一方法进行了测试，并成功建立了高效的40 kb DNA回收方法；同时，利用改良的方法回收到的DNA样品构建了Fosmid文库，并对文库中插入的外源DNA片段大小进行评估，结果显示:高效、准确的40 kb DNA回收方法大大降低了Fosmid文库构建的难度。综上所述，本研究对Fosmid文库构建过程中，样品DNA片段的制备方法进行改良，旨在为科学构建Fosmid文库提供改进方向和实验证据，为生物的基因组学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Fosmid载体质粒pFosill-2（Genbank登录号JX069762）［30］，由美国 Broad 研究所 Andreas Gnirke博士惠赠；所用籼型水稻品种是华占。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 水稻华占基因组DNA，用 CTAB 法提取［31］。

1.2.2 基因组DNA的定量与打断 利用Qubit 3.0荧光计（Invitrogen，美国）测定水稻基因组DNA浓度，用无菌双蒸水将浓度调至200 ng/μL；吸取40 μL DNA溶液加入到g-TUBE（Covaris，美国）中，5 000 r/min离心3 min后，将g-TUBE倒转放入离心机，5 000 r/min离心3 min，上述步骤重复5次后，吸出打断后的DNA样品于新离心管中备用。重复上述步骤，直至得到足够量的打断DNA，然后利用脉冲电泳检测打断DNA的片段分布，确保主要片段集中在40 kb左右。

1.2.3 基因组DNA片段的分选与回收 打断后的DNA加入Loading buffer备用，使用全自动核酸/蛋白质回收仪SageELF（Sage science，美国）进行DNA片段的分选与回收。选用0.75%琼脂糖胶盒（Agarose Gel cassette，Sage science，美国），根据操作说明进行并有改动。主要步骤如下:排除胶盒气泡并清洗胶盒上的回收孔，然后将胶盒置于仪器上的盒槽中并设置恰当的缓冲液水平。电流测试通过后，在胶盒的点样孔中加入准备好的DNA样品，注意上样量不超过60 μL，选用“时间”模式，电泳10 h，为了避免长时间电泳过程中电泳液的蒸发，每隔3 h暂停一次，补水约3-5 mL并混匀。电泳结束后，收集每个回收孔中的DNA于一新离心管中，用Qubit 3.0测定每孔回收到的DNA浓度，回收的DNA可短期保存于4℃。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳（Pulse-Field Gel Electrophoresis，PFGE）检测DNA片段大小 利用SeaKem®Gold Agarose（Lonza，德国）及0.5×TBE电泳缓冲液制备1%的琼脂糖凝胶，使用脉冲场凝胶电泳仪（Rotaphor 6.0，Analytik Jena，德国）检测DNA片段大小，操作按照仪器说明书进行，电泳条件如下:电压180 V，脉冲夹角120°，间隔时间60 s，温度13℃，电泳时间24 h。电泳结束后，将胶块放入GelRed（Vazyme，南京）溶液中染色约30 min，蒸馏水脱色约10 min，然后用凝胶成像系统（GelDoc XR+，BioRad，美国）拍摄图像。

1.2.5 Fosmid文库的构建 首先，对载体质粒pFosill-2线性化与去磷酸化:取200 μg pFosill-2 DNA，使用 Plasmid-SafeTMATP-Dependent Dnase（Epicentre，美国）进行消化以去除载体质粒提取过程中发生断裂的DNA，使用0.8×磁珠（VAHTS DNA Clean Beads，Vazyme，南京）纯化出环状载体质粒DNA后，利用AatII（Fermentas，美国）及Eco72I（Fermentas，美国）对其双酶切以获得两端的载体臂，0.8×磁珠纯化酶切产物，接着使用Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（NEB，英国）进行去磷酸化，最后用酚/氯仿抽提两次纯化载体臂。

接着，利用KAPA Library Preparation Kit（KAPA biosystems，美国）对基因组DNA片段进行末端补平，0.8×磁珠纯化补平产物后，利用KAPA T4 DNA Ligase（KAPA biosystems，美国）连接载体臂与基因组DNA片段，室温连接1 h后，70℃处理10 min终止反应。然后，使用MaxPlaxTMLambda 噬菌体包装提取物（Epicentre，美国）对连接产物进行体外包装，包装产物侵染大肠杆菌菌株DH10T，然后将侵染反应液涂布于含12.5 μg/mL氯霉素的固体LB培养基表面，置于37℃培养箱，倒置培养过夜。同时，将包装产物分别稀释10倍、100倍、1 000倍3个梯度侵染DH10T后培养，用于文库滴度检测。

1.2.6 文库重组克隆的分析 从上一步的培养皿中，随机挑选10个单克隆，分别接种于50 mL LB液体培养基（包含34 μg/mL氯霉素）摇培过夜，使用碱裂解法提取重组质粒后，酶切质粒DNA检测阳性率。随后，又随机挑选25个单克隆，分别接种于1 mL LB液体培养基摇培约15 h后，分成两份:一份送苏州金唯智生物科技有限公司或者生工生物工程（上海）股份有限公司，利用pFosill-2载体插入位点两侧的T7和SP6启动子位点对每个重组质粒的两端进行Sanger测序，获得的序列与蜀恢498的基因组序列（http://www.mbkbase.org/）进行Blast分析，从而获知插入片段的大小；另一份进行扩大培养并提取重组质粒，每个重组质粒取1 μg使用NotI（Thermo Fisher，美国）37℃酶切3 h，随后PFGE检测（电压130 V，脉冲夹角120°，间隔时间4 s，温度10℃，电泳时间18 h）载体带以及外源基因组DNA片段的酶切带型。最后，根据末端测序的结果下载蜀恢498的基因组序列，利用CodonCode Aligner软件（CodonCode Corporation，美国）进行电子酶切模拟，得到虚拟酶切图，与PFGE电泳图进行对比。

2 结果

2.1 改进的Sage ELF操作流程可准确、高效地回收40 kb左右的DNA片段

为回收40 kb的DNA片段，将提取的基因组DNA经g-TUBE打断后，取20 μg利用SageELF仪器进行DNA片段的分选与回收。每个回收孔的DNA，均取50-100 ng进行PFGE电泳检测。通过测试不同的SageELF电泳时间发现，10 h的电泳可以有效地将10-50 kb的基因组DNA分开，此时，40 kb左右的DNA片段位于胶盒的第1-3孔，虽然这3个孔的DNA呈弥散分布，但仍可看出主带在40 kb附近，甚至有少量DNA片段稍大于48.5 kb（图1），这部分DNA可用来构建Fosmid文库。此后的回收孔中，DNA片段大小依次降低且没有呈弥散分布，第4孔的DNA主带大小约30 kb，到最后一孔即第13孔，DNA主带大小在12 kb-15 kb之间（图1）。

利用Qubit 3.0测定每个孔回收到的DNA浓度发现，第1孔至第13孔依次回收得到275 ng、2 266 ng、4 576 ng、1 452ng、831 ng、649 ng、466 ng、451 ng、329 ng、311 ng、119 ng、243 ng DNA。打断的DNA片段大小峰值在40 kb。因此，回收量最高的DNA片段也集中在40 kb附近，这与预期的结果一致。以上DNA长度和浓度检测说明，利用改进的SageELF的电泳回收程序，可以高效地回收长度达40 kb的DNA片段，且操作流程简单易掌握。高浓度40 kb DNA片段的获得为Fosmid文库的构建奠定了坚实的基础。

2.2 Fosmid文库滴度及重组质粒的插入片段大小分析

为检测文库容量以及覆盖率，包装产物用Phage Dilution Buffer稀释10倍、100倍、1 000倍3个梯度，混匀后分别取20 μL加入200 μL的大肠杆菌DH10T细胞中，37℃孵育30 min后涂氯霉素平板，倒置于37℃培养过夜。稀释100倍的平板上，平均每个平板长出12个单克隆，那么文库的总滴度约为12×100×1 000 / 20 = 6×104CFU/mL。

由于28-45 kb的外源DNA片段包装后可高效进入λ噬菌体头部，本研究将第1至3孔的DNA混合，按照Williams等［30］的方法成功地构建了Fosmid文库。为了初步检测文库质量，随机挑选文库的10个单克隆，提取少量质粒DNA，用限制性内切酶AatII和Eco72I作双酶切后进行PFGE分析发现，10个质粒均有外源DNA插入，文库阳性率为100%。但是，质粒的酶切产物条带过多，难以推测准确的外源DNA长度（数据未展示）。为了检测文库中外源DNA片段的准确大小，我们又随机挑选了25个单克隆进行双末端Sanger测序并成功获得了24个克隆的双末端序列，这些序列与蜀恢498的基因组序列［18］比对结果如表1所示，插入的外源DNA片段大小在23 kb-52 kb之间，每个克隆的平均插入片段大小约为37.9 kb，标准差为5.2 kb，片段大小比较集中。

图1 Sage ELF回收的DNA片段的PFGE分析

为了进一步确认测序克隆中插入的外源DNA片段大小，对表1中的25个克隆，提取质粒，用NotI酶切（可以切出完整的载体片段）后，进行PFGE检测。如图2-A所示，酶切后的每个质粒都包含一条约7 kb的载体带（箭头所指）。为了便于分析外源DNA片段的酶切带型，我们根据表1中蜀恢498的基因组位置信息，将对应的DNA序列提取出来，然后分析其中的NotI识别位点的位置和数量，最后根据此结果预测外源片段的酶切带型（图2-B）。结果发现，除6号、9号、11号、12号、14号和20号克隆外，其他18个克隆的酶切带型都与预测的带型一致，进一步验证了外源DNA片段的大小。

3 讨论

Fosmid文库在基因克隆、物理图谱构建及基因组测序等工作中被广泛应用［1-12］。最近几年，Fosmid文库与高通量测序技术相结合，如在人类单倍型测序［23，30］、辅助基因组de novo组装［18］及宏基因组学研究［25-26］等方面，发挥了其独特的作用，使Fosmid文库在基因组学研究中的地位更加重要。但常规的Fosmid文库构建过程，尤其是40 kb DNA片段的回收，操作难度很大，限制了Fosmid文库构建的成功率，因此改良Fosmid文库的构建方法很有必要。

表1 测序克隆中插入的外源DNA位置信息

图2 重组质粒的Not I酶切分析

自Kim等［27］于1992年创建第一个Fosmid文库以来，构建Fosmid文库的方法就一直被改进。但目前看来，改进Fosmid载体的情况较多，外源基因组DNA片段的分选和回收方法，还是依赖传统的切胶并用透析袋回收或者密度梯度离心回收。切胶回收DNA，需经过PFGE、切胶、透析袋回收3步，流程比较麻烦；而密度梯度离心回收DNA，需经过超速离心、穿刺取样、透析纯化等步骤，流程更加繁琐。这两种方法，实验操作难度很大，技巧性也高，研究者往往难以快速掌握，且这些方法的DNA回收率也很低。利用我们改进的方法，只需将打断后的基因组DNA加到SageELF胶盒点样孔中，中间步骤完全由机器操作，最后从胶盒回收孔中吸取不同区段的DNA即可直接进行后续的分子生物学操作，流程简单、便捷。

全自动核酸/蛋白质回收系统SageELF是Sage Science公司2015年推出的仪器，将传统的切胶并利用透析袋回收DNA的过程自动化，不仅简化了利用透析袋回收DNA的操作流程，也提高了DNA的回收效率。目前，SageELF被广泛应用于新一代测序领域中，小至100 bp、大至20 kb左右的不同长度的DNA片段回收［29］。但是，SageELF仪器的中没有设置回收40 kb的方法，显然，Fosmid文库的构建，不是厂家考虑到的应用。与常规的Biorad的箝位匀强电场系统（CHEF）不同，SageELF使用的是横向交变电泳（TAFE），其电泳液的体积只有大约20 mL，如果用于40 kb片段的分离，需要长时间、高电流电泳。但是，在如此小的体积中长时间进行高电流电泳，极易导致电泳液温度过高和蒸发，因此，我们做了一系列的电流、脉冲时间的测试，并调整了仪器相应的运行监控参数，最终成功的从20 μg的input DNA中回收到约8 μg的40 kb左右的DNA。而实际上，使用Epicentre和Lucigen等公司的试剂盒，只需要100 ng-1 μg的40 kb DNA用于Fosmid文库构建。因此，我们建立的方法，可以很容易地回收到足够的40 kb DNA片段，大大降低了Fosmid文库构建的难度。

4 结论

本研究通过改进全自动核酸/蛋白质回收系统SageELF的操作流程，实现了40 kb DNA片段的高效回收。利用我们改良的SageELF法回收40 kb左右的基因组DNA大片段，操作便捷，回收率高，片段大小精准，且文库插入片段集中，显著提高了Fosmid文库的构建质量。