抗虫转基因甘蔗的培育及其抗性丧失的防控策略

冯翠莲 张树珍

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗研究中心 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101）

甘蔗（Saccharum officinarumL.）属于单子叶植物禾本科甘蔗属，是我国最重要的糖料作物。一直以来，蔗糖占食糖总产量的比例都在70%以上，在2018/2019榨季，蔗糖产量则占全国食糖产量88%［1］。甘蔗也是迄今最成功的可再生能源植物，通过发酵生产出的燃料乙醇占世界燃料乙醇的40%［2］。因此甘蔗产业对国民经济具有重要的意义。近年来由于高产、高糖甘蔗品种的大面积使用，但缺乏相应的抗虫品种，甘蔗虫害日益严重。甘蔗在大田的整个生长发育期内可受到120余种虫害威胁［3］，其中条螟、大螟等各种螟虫的危害尤其严重，苗期受害造成枯心，生长期受害造成虫害节、虫害茎，严重影响产量。甘蔗另一类害虫——同翅目的绵蚜、粉蚧等，虽然直接造成的产量损失并不如螟虫的严重，但其危害时传播甘蔗花叶病等多种甘蔗病毒，是甘蔗多种病毒的传播媒介。因此，其造成的间接损失比直接危害造成的损失更为严重。

到目前为止，对于甘蔗害虫的防治主要依赖化学防治，但长期大量施用化学农药造成一系列的环境污染、农药残留等严重问题，因此培育抗虫甘蔗新种质是甘蔗育种的一个重要目标。然而甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物，其遗传背景十分复杂，基因组巨大，通常表现为异源多倍体和多倍的非整倍体［4］，给育种工作带来很大的盲目性；另一方面由于缺乏甘蔗抗虫种质资源，因此要想通过常规的杂交育种方法和程序在优良品种中引入抗源无疑是非常困难的。除此以外，甘蔗有性杂交经常遇到开花困难、花期不遇、杂交不孕和不育等问题［5］，最终导致甘蔗的抗虫育种工作远远落后于其它作物。然而，基因工程可以定向改变作物的某些性状，在棉花、玉米、大豆等作物上改良其抗虫性的转基因技术越来越广泛应用。在常规条件下栽培种甘蔗不容易开花，或即便开花也表现为花粉败育授粉困难，因此由花粉引起的基因漂移的潜在风险极小。以及甘蔗原料的工业制成品不含转基因蛋白，因此转基因甘蔗是转基因风险最低、转基因安全等级最高的植物之一［2］。随着甘蔗组织培养和离体再生等技术体系日渐成熟，因此利用转基因技术提高甘蔗抗虫性将是甘蔗抗虫育种的重要新途径。

1 转基因甘蔗遗传转化体系的发展及遗传稳定性的研究

转基因甘蔗的研究始于20世纪90年代初，经过30年的努力，取得了很大的成果。以胚性愈伤组织为受体细胞，以基因枪或农杆菌介导为转化方法的转化体系，以及以抗生素、除草剂为筛选剂的筛选方法已经比较成熟。但仍然存在转化效率低，转基因沉默等问题，不足以支持转基因甘蔗的规模化生产，因此国内外相关研究者对建立高效广谱稳定的遗传转化及筛选的研究依然进行中。

1.1 转基因甘蔗的转化

转基因的转化是遗传转化的主体部分，是转基因是否成功的关键，包括转化受体细胞的选择、转化方法等。纵观目前已发表的甘蔗转基因相关论文，转化受体细胞最有效的依然是胚性愈伤细胞。针对转化受体细胞，Manickavasagam等［6］曾尝试使用腋芽，以农杆菌共培养法转化，获得的转基因甘蔗存在嵌合体严重的问题，实验结果不理想，再一次证实当前最理想的转化受体是胚性愈伤细胞。

目前，转基因甘蔗主要的转化方法包括基因枪和农杆菌介导法。甘蔗遗传转化的最早报道在1992年，Bower和Birch 就是利用基因枪法把Npt-II和B-Glucuronidase基因导入甘蔗中，利用Geneticin（G418）和GUS染色筛选得到第一批转基因甘蔗［7-8］。之后利用该法相继获得了抗虫、抗除草剂、抗病、抗旱等转基因甘蔗和作为生物反应器的转基因甘蔗。但基因枪法存在成本高、遗传转化效率低、拷贝数高，转化植株的稳定性差等因素的限制，阻碍其在甘蔗转基因中的广泛应用。而农杆菌介导法具有成本低、成功率高、导入的外源基因多为单拷贝，遗传稳定性好的优点，更有利于转基因材料的生产化应用，因此农杆菌介导的遗传转化方法在甘蔗转基因应用中迅速发展。

1998 年 Arencibia等［9］和 Elliott等［10］分别把Hpt和Gfp基因成功导入甘蔗中，通过潮霉素筛选和荧光检测筛选，首次建立了甘蔗农杆菌介导法转化系统。同年 Enríquez-Obregón 等［11］利用农杆菌介导法把bar基因导入甘蔗中，使用草胺膦除草剂筛选获得首例抗除草剂转基因甘蔗。2007年，Zhangsun等［12］系 统 地 比 较 了 甘 蔗 品 种（FN81-745和Badila）、农杆菌菌株（LBA4404，EHA105和A281）及其最适浓度、筛选剂（hpt II/Hyg），bar/PPT和npt II/G418）、培养基成分、植物组织共培养的方法等因素对根癌农杆菌转化效率的影响，并对以上因素进行了优化，建立了农杆菌介导的甘蔗转化的有效方案。然而以上方案的转化效率仍然比较低，不足以满足转基因甘蔗大规模商业化的需求。为了实现转基因甘蔗商业化的需求，先正达公司投入大量的人力和物力，于2010年前后开始与世界上掌握农杆菌介导法转化甘蔗技术的几个实验室合作，共同研发高效广谱稳定的甘蔗农杆菌介导的转化体系，本研究室有幸成为合作者之一。据2014年先正达公司的研发人员Dong等［13］报道，农杆菌转化后共培养阶段进行干燥处理是高效转化的关键，该法对甘蔗品种Q117 和L97-128 的转化效率均可达到每克侵染愈伤获得20个株系，现已在两个不同的实验室中由超过6名研究人员在CP72-1210、Q208、KQ228、SP70-1143、CP89-2143、L99-226、L99-233 和 CP84-1198八个以上的甘蔗品种中得到验证，是迄今为止报道的最稳定的甘蔗转化体系，并证实了外源基因在各个转基因甘蔗品种及其多个生长季节中的稳定表达。证明了该转化技术可以满足转基因甘蔗大规模商业化的需求。

1.2 转基因甘蔗的筛选

转基因筛选是遗传转化的重要部分，是能否成功从大量的非转化细胞中选择并有效增值转化细胞的关键。用于转基因甘蔗的筛选基因可以分为两大类，一是包括抗生素和抗除草剂在内的抗性基因；二是磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）等对生物安全的非抗性标记基因。

抗生素是转基因甘蔗筛选最早使用的筛选剂，主要有Kan/卡那霉素、Npt-II/新霉素（G418），Hpt II/潮霉素等，抗生素筛选普遍存在筛选率低，假阳性高的缺点，如经Hpt/潮霉素筛选的转化事情的转化率仅为0.63%，Npt II/G418筛选的转化率为1.38%［14］。另一方面随着公众对转基因作物安全性问题的越来越关注。使用抗生素作为筛选剂已经慢慢被淘汰。

除草剂既能用于筛选转基因甘蔗细胞，同时又赋予了转基因甘蔗抗除草剂的特性，因此除草剂作为转基因细胞筛选剂的应用更为广泛。编码膦丝菌素乙酰转移酶（Phosphinthricin acetyltransferase，PAT）的bar基因是最早最普遍应用于转基因甘蔗筛选的抗除草剂基因，但仍然存在转化率低的问题，如2015年Zhang等［14］报道经bar/PPT筛选后的转化率仅为0.47%［14］（转化率低的原因跟转化方法也有关系）。本实验室自2000年以来一直致力于研究农杆菌介导法遗传转化甘蔗，通过对甘蔗胚性愈伤组织诱导、农杆菌转化条件及转化体筛选等过程的优化，经bar/basta筛选后转化效率和筛选效率得到了极显著的提高，分别提高到20%和90%［15-16］。然而草胺膦、basta等除草剂由于使用成本高，因此未广泛使用；而另一种广泛使用的草甘膦，由于近10多年来，大量抗草甘膦转基因作物品种的推广和种植，导致抗草甘膦杂草的产生，基于以上两原因，人们开始寻找不同类型的抗除草剂基因作为转基因甘蔗的筛选基因。乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）抑制剂除草剂是抗草甘膦转基因作物品种大量种植之前主要使用的除草剂。近年来在多种杂草及作物上发现突变的ALS基因会产生抗除草剂的性能，因而突变的mALS基因作为筛选基因成为人们的首选。2013年，Vyver等［17］第一个利用植物来源的抗磺酰脲除草剂的突变mALS基因应用于甘蔗转化细胞，首次建立来源于烟草的突变乙酰乳酸合酶基因（mALS）/氯磺隆除草剂筛选技术，利用基因枪轰击法，筛选率为75%，逃逸率25%，但筛选效率比nptII/G418筛选效率低；而Dermawan等［18］则于2016年利用来源于高粱的mALS基因，同样使用基因枪转化法，建立了高粱突变乙酰乳酸合酶基因/双草醚除草剂筛选技术，此筛选效率与nptII/geneticin筛选效率相当，但比烟草mALS基因/氯磺隆除草剂的筛选效率高，文中作者推测可能是高粱跟甘蔗的亲缘关系比烟草跟甘蔗的更接近的缘故。此类转基因甘蔗可抗氯磺隆、甲磺隆、氯嘧磺隆、双草醚等磺酰脲类除草剂。

随着转基因作物的商品化，抗性筛选基因潜在的生态和食用安全性越来越受关注。因此研究者不断寻找比除草剂更为安全有效的筛选标记基因。如正向选择筛选剂甘露糖pmi/mannose。2007年，Jain等［19］通过基因枪轰击法，首次在甘蔗转化细胞筛选中应用了pmi/mannose，获得的转化效率为7.4%。2015年，Zhang等［14］，同样利用基因枪轰击法，系统的比较了常用的几种筛选方法的转化率，经PCR和CPR检测，pmi/mannose筛选的转化率为4.2%，bar/PPT的转化率为0.47%，npt II/G418的转化率为1.38%，而hpt/Hygromycin的转化率为0.63%，由此可见pmi/mannose筛选的转化率是最高的。上述报道的pmi/mannose的转化率较低，很大原因在于基因枪轰击法转化效率低。2015年，本研究团队王文治等［20］应用本室成熟的农杆菌介导甘蔗转基因技术，成功建立了高效的农杆菌介导的甘蔗转基因甘露糖筛选技术，单次转化4 g愈伤组织可以获得30个以上的转基因株系，pmi/mannose的筛选阳性效率达到87%，该技术具有转化效率高、转化基因型广、转化体稳定性好并可实现多基因同时转化等特点。

1.3 转基因甘蔗遗传稳定性的研究

转基因的遗传和表达稳定性是转基因甘蔗的成功商业化应用的关键因素。T-DNA插入序列的稳定性和转基因表达一致性在转基因甘蔗中尤为重要，因为甘蔗种植涉及宿根和新植等无性营养繁殖。然而，关于无性营养繁殖植物中的转基因稳定性研究的报道并不多。转基因甘蔗存在转基因沉默或其他会影响转基因稳定性的遗传重排的可能性。据早期的报道，在甘蔗T0中存在转基因沉默，转基因拷贝数，发育调节和转录或转录后机制都有可能影响转基因稳定性［21-24］；而2014年有报道表明在第一代宿根甘蔗中，GUS、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II和细菌内切葡聚糖酶的转基因表达活性有所提高［25-26］。此外，Joyce等［27］报道了新霉素磷酸转移酶（NPTII）蛋白质在第一代和第二代宿根甘蔗中则可以稳定地积累。关于不同繁殖方法和连续宿根多年的转基因甘蔗的外源基因表达一致性的综合研究更是寥寥无几，先正达公司为推进转基因甘蔗的商品化生产，对多个转基因甘蔗的外源基因的遗传稳定性及表达一致性进行了为期4年的深入研究。据其研发人员Caffall等［28］报道，以在美国和巴西广泛种植的3个甘蔗商业品种L97-128、CP84-1198和SP70-1143为受体，经过农杆菌介导法得到17个转基因事件，于2009-2013年间，系统的监测了这些植株的外源基因PMI或荧光蛋白基因AmCYAN1在田间连续宿根四代和新植无性繁殖后代的甘蔗基因组中的稳定性和转基因表达一致性。结果显示包括外源基因在内的整个T-DNA插入序列可在各世代中稳定遗传，没有观察到转基因重排或丢失；AmCYAN1和PMI在各世代中并没有发生转基因沉默，蛋白表达水平一致。这些结果为转基因甘蔗成功商业化提供了理论依据。

1.4 转基因甘蔗安全性评价

转基因甘蔗的安全性评价是关系到转基因甘蔗能否顺利推广应用的关键所在。由于甘蔗无性繁殖的特性，甘蔗开花困难、自然条件下授粉困难，以及甘蔗原料的工业制成品不含转基因蛋白，因此转基因甘蔗是转基因安全等级较高的植物。转基因甘蔗安全性评价总体要求跟其他作物一致。转基因甘蔗经过研究实验、中间试验、环境释放和生产性试验等试验程序，并取得安全证书才算是被国家认定为安全的具备商业化可能性的对象。但国家认定为安全并不意味着可以商业化种植，还要经过品种登记程序才具备商业化推广的资格。据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）截至2020年2月在其网站发布的数据，获得安全证书的甘蔗转基因事件共有6例［29］:（1）2017年巴西国家生物安全技术委员会批准了BT（Cry1Ab）抗虫转基因甘蔗CTB141175/01-A在巴西的商业化应用，包括用于食品、饲料和种植或释放到环境中，它是巴西甘蔗技术中心（Centro de Tecnologia Canavieira，CTC）的研发产品。据报道，该转基因甘蔗于2018年开始在巴西种植，面积约为400 hm2，这是世界上第一个商业化种植的转基因甘蔗品种［30］，同时该品种于2018年在加拿大、美国获得用于食品的安全证书。（2）巴西甘蔗技术中心研发的另一个BT（Cry1Ac）抗虫转基因甘蔗CTC91087-6和CTC93209-4两个株系于2018年获得巴西国家生物安全技术委员会的批准，可在巴西商业化应用，包括用于食品、饲料和种植或释放到环境中。（3）转入来源于大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因（EcBetA）耐旱转基因甘蔗的NXI-1T，于2011年获得印度尼西亚生物安全委员会的用于食品和种植或释放到环境的安全证书；（4）其余两例是转入来源于苜蓿根瘤菌的胆碱脱氢酶基因（RmBetA）耐旱转基因甘蔗的NXI-4T、NXI-6T两个株系，于2013年获得印度尼西亚生物安全委员会的用于食品和种植或释放到环境的安全证书，其中NXI-4T品种于2018年获得用于饲料的安全证书，至此该株系完成了所有安全评估，商品化应用指日可待。由此可见，随着转基因技术和安全评价体系的不断完善与发展，尤其基因编辑新技术的应用，转基因甘蔗商品化应用将越来越广泛。

2 抗虫转基因甘蔗研究进展

2.1 国内外抗虫转基因甘蔗研究现状

抗虫转基因是甘蔗各类转基因研究中最成功的领域。迄今为止，美国、澳大利亚、巴西、南非、古巴、泰国、印度、新加坡、中国等都先后开展了甘蔗抗虫转基因研究。由于Bt基因表达的毒蛋白可特异性地毒杀鳞翅目、同翅目、鞘翅目和双翅目等害虫，却对人畜无害，因此在甘蔗抗虫转基因研究中应用最广。自1994年首次应用Cry1Ac基因转化甘蔗获得抗螟虫的转基因甘蔗后，Cry1Ab、Cry1Aa3、Cry2A、Cry2Ab及人工改造的Cry1Ac均相继被转入甘蔗中，于2017年获得全球首例商业化种植许可的转基因甘蔗品种正是转入了BT（Cry1Ab）抗虫基因。除此以外，在甘蔗抗虫转基因中应用的还有雪花莲凝集素（GNA）及蛋白酶抑制剂（PI）基因、胰蛋白酶抑制剂（SKTI）基因、大豆抑制剂（SBBI）基因、野苋菜凝集素（AVA）基因等。另一方面除了利用单价的抗虫基因外，利用Bt基因与其他类型的抗虫基因组合，构成双价和融合抗虫基因也慢慢发展起来。到目前为止，具有较好抗虫性的转基因甘蔗的文献详见表1。

2.2 我国抗虫转基因甘蔗研究存在的问题

根据表1已报到的文献，国内转基因甘蔗的转化方法主要以基因枪轰击为主，获得的转基因植株外源基因拷贝数多，有的受体植株的农艺性状受到严重影响，导致转基因材料难以应用于生产。如2016年，高世武等［46］把CrylAc基因转入甘蔗高糖品种FN15，转基因植株的外源基因的拷贝数1-148不等，毒蛋白在叶中表达量高、转基因植株的螟虫受害率低，但CrylAc基因拷贝数越多、表达量越高对植株的农艺性状影响越大；另外我国科研人员Weng等［41］通过提高CrylAc基因中GC含量，从37.4%增加至47.5%，并再次提高至54.8%，获得的转基因甘蔗内毒蛋白的表达量和转基因甘蔗对螟虫的抗性虽然很高，但经过抗虫性及重要经济、农艺性状的评价后发现，除了抗虫性外，总体而言，经济性状都不如原供体品种，很难直接从中选育抗虫品种用于甘蔗生产。分析其原因推测是所得的转基因甘蔗由基因枪轰击而获得的，CrylAc基因的拷贝数多（4-11），毒蛋白大量在甘蔗体内积累而影响了甘蔗正常的生长发育。由此可见，由基因枪轰击获得的转基因甘蔗普遍存在外源基因拷贝数多的问题，基因枪轰击法难以控制外源基因插入的拷贝数，因此具有外源基因插入拷贝数少的优点的根癌农杆菌介导法则更适合用于转基因甘蔗。

表1 抗虫转基因甘蔗

然而目前国内只有少数科研团队掌握根癌农杆菌介导法转化甘蔗的技术。本研究团队自20世纪90年代末起，一直致力于农杆菌介导法转化甘蔗的研究，经过近20年的努力，取得了一些进展。目前通过根癌农杆菌介导法，已获得外源基因的拷贝数为1-3个低拷贝的多个转基因株系，并通过初步抗虫性测定和农艺性状测定，从中筛选出数个具有较好抗虫效果和农艺性状未受影响的转基因株系，目前正在对所获得的转基因甘蔗无性系后代进行遗传稳定性评价和农艺性状的进一步鉴定。此项工作有望解决由于外源基因拷贝数多而影响甘蔗产量的问题。

此外，从表1还可以发现，应用于转基因甘蔗的抗虫基因单一，抗虫效果有效的基因仍然以Bt为主。现急需发掘更多有效的Bt基因及其他抗虫基因资源。

3 延缓和防止转基因甘蔗抗虫性丧失的策略

当抗虫转基因作物大规模的商业化种植后，靶标害虫种群长期处于较高的选择压力下，最终导致靶标害虫对转基因作物产生抗性，害虫一旦产生抗性，转基因作物的抗性则丧失［65］。随着转Bt基因作物商业化种植的时间推移，害虫对转基因植物产生抗性的问题逐渐暴露出来。据报道自然条件下转基因作物连续种植6年后，棉铃虫将对Bt作物产生抗性。目前田间已发现的对Bt作物产生抗性的昆虫除了棉铃虫外还有草地贪夜蛾、棉红铃虫、玉米根萤叶甲和玉米茎蛀褐夜蛾等，涉及的Bt基因有cry1Ab、cry1Ac、cry1F和cry3Bb［66］，每一个抗虫转基因作物在商业化生产前都需要投入大量资金进行研发，但当靶标害虫通过适应和变异获得抗性进化后，对转基因作物产生抗性，该转基因作物将可能毁于一旦，丧失了原有商品价值。因此靶标害虫的抗性进化是抗虫转基因作物商业化生产的最大威胁，延缓和防止转基因甘蔗抗虫性的丧失已成为抗虫转基因的一个不可忽视的研究内容。综合当前国内外的研究，延缓和防止抗虫转基因作物丧失抗虫性的主要有效策略有“高剂量-庇护所”（HDR）的治理策略和多个抗虫基因聚合策略。

3.1 “高剂量-庇护所”策略

针对害虫对Bt蛋白产生抗性，Bt作物丧失抗虫性的问题，美国和加拿大政府提出了抗性治理“高剂量/庇护所”策略，它是根据昆虫生态学和种群遗传学等理论，经过计算机模拟研究结果而提出的，是目前国内外最为广泛应用的延缓和防止Bt作物丧失抗虫性的治理策略［67-68］。

高剂量是指转Bt基因作物表达足以杀死所有敏感品系和抗性品系的杂合子靶标害虫的杀虫蛋白。由于Bt基因来源于苏云金芽孢杆菌，存在在植物中表达量极低的问题。有专家曾对原始的Bt基因进行植物偏爱性的密码子优化，以期提高Bt基因在转基因作物中的表达量，改造措施包括消除AT富集区、增加GC含量、添加引导序列和加尾识别信号等［69］。其中我国甘蔗研究专家Weng等［40-41］将CrylAc基因中GC含量从37.4%增加至47.5%，由Ubi启动子驱动转化甘蔗，获得的转基因甘蔗组织内毒蛋白的量是Arencibia等报道的7倍多；2011年该作者通过进一步改造CrylAc基因，再次将GC含量提高至54.8%，获得的转基因甘蔗的毒蛋白表达量达到每毫克可溶性蛋白含2.2-50.0 ng，该甘蔗对螟虫的抗性提高了5倍。2012年，陈勇生等［42］对上述的其中6个转Bt基因甘蔗品系进行了抗虫性评价，结果显示不同的转基因甘蔗品系均表现出良好的抗（螟）虫性，表现最好的两个株系的螟害株率和螟害节率比相应的对照品种降低100%，螟害株率和螟害节率均为零。

庇护所是在抗虫转基因作物的附近种植一定比例的非转基因作物，从而为敏感种群提供庇护所，该种群可与已对Bt作物产生抗性的种群进行随机交配，防止抗性纯合个体的产生，从而稀释抗性基因，延缓害虫抗性的产生，防止Bt作物抗性的丧失［67］。如在美国，环保局规定需要保留4%的面积种植不使用任何化学杀虫剂的非Bt转基因作物，或保留20%-30%的面积种植可使用化学杀虫剂的非Bt转基因作物［70］，在这种严格采取“高剂量-庇护所”策略的地区里，到目前为止尚未有大规模显著的靶标害虫产生抗性的报道。在我国，以小农种植模式为主，转基因棉花多与其他作物（如玉米、大豆和小麦）连片种植，而棉铃虫的寄主除了棉花，还有小麦、玉米、大豆、谷子等多种作物，这些作物可作为天然庇护所，因此可有效控制靶标害虫的抗性发展，防止Bt作物抗虫性的丧失［71］。

3.2 多基因聚合策略

基因聚合是将两种或两种以上作用方式不同的抗虫基因或者其他抗虫基因同时转入同一种作物，形成双价或多价抗虫作物，此策略不仅能有效地增强转基因作物的抗虫性，还可以拓宽抗虫作物的杀虫谱，是延缓转基因作物抗虫性下降甚至丧失的有效途径，该策略在美国已被广泛采用。

多基因聚合策略要考虑每个单独基因都有极强的作用和聚合后交叉抗性几率低的两个基本原则，这样，靶标害虫同时对两种不同抗虫蛋白产生抗性的几率就会大大降低。据报道，Cry1Ac和Cry2Ab的聚合是现在应用最广泛、效果也很好的聚合策略［72］，因为两者的氨基酸同源性低且在昆虫中肠的作用位点不同，从而使昆虫对它们产生交叉抗性的概率很低。此外，Cry1A类蛋白和 Cry1C、Cry9C、Cry1Ie在昆虫肠道的结合位点也是不同的，因此cry1Ab/c和cry1C、cry1Ab/c和cry1Ie也是具有潜在价值的基因组合［73］。另外，还有报道cry34Ab和cry35Ab是对西方玉米根虫非常有效的双价聚合基因［74］。

多基因聚合在玉米、棉花等作物上应用已经非常广泛。转基因作物种植大国如美国、澳大利亚、印度等种植的转基因抗虫棉已经由单价抗虫棉逐渐过渡到双价甚至多价的抗虫棉。2010年在美国和加拿大上市的SmartstaxTM转基因玉米（孟山都公司和陶氏公司研发）利用已获得的MON89034、TC1507、MON88017和DAS-59122-7 4个转基因玉米，按常规杂交的方法将6个抗虫基因（cry1A.105、cry1Ab、cry2Ab、cry1Fa四个抗鳞翅目昆虫基因和cry34Ab、cry35Ab两个抗根部害虫基因）和两个抗除草剂基因（pat和epsps/cp4）聚合到一起，育成抗多种害虫及抗除草剂的SmartStaxTM新品种，任何一种靶标害虫都很难在短期内对其产生抗性，从而实现了对多种昆虫和除草剂的抗性，该品种具有极高的商品应用价值［75］。而在抗虫转基因甘蔗方面，2018年巴西孟山都公司把Cry2Ab、Cry1Ab、EPSPS-CP4构建于一个表达盒中，通过一次转化完成3个基因的聚合，获得的转基因甘蔗在田间试验中表现了很好地螟抗性和草甘膦耐受性，并通过模拟实验证明:若保持甘蔗螟虫100代内不产生抗性，双价抗虫基因甘蔗比相应的单价抗虫甘蔗需要更小的避难所和具有更大的抗虫耐久性，也就说多抗虫基因更能延迟害虫抗性的演变，保持更持久的抗虫性［76］。

国内，在多基因抗虫转基因甘蔗方面也做了一些研究:邓智年［77］利用六氨基酸的柔性多肽把杀虫基因AVAc和CpT1融合转化甘蔗，吴转娣等［78］把Bt和sck双价抗虫基因导入甘蔗。本研究团队的成员王文治［53］把具有4个独立阅读框的bar、Cry1Ab等以农杆菌介导法导入甘蔗中，并证实了4个基因可以在少数的转基因甘蔗的T1和T2无性繁殖后代中稳定遗传，并有效表达。但4个基因均使用同一个启动子和终止子，即连锁基因转化，由于相同启动子终止子间的干扰，随着转基因甘蔗的生长发育，引起基因沉默可能较大。针对连锁基因转化法的缺点，本文作者利用具有自我剪切功能的连接多肽FMDV 2A序列将CryIAc和gna两个不同抗虫机制的基因融合后，通过农杆菌介导转化甘蔗，实现两个蛋白在甘蔗体内的同步表达并独立行使各自功能的目标，从而培育抗螟虫绵蚜以及蛴螬等多种害虫，并具有持久抗虫性的甘蔗新品种。已得到的转基因甘蔗到目前已经无性繁殖了6个世代，其抗虫稳定性仍然保持良好［79-80］。目前转基因甘蔗的安全评价后续工作正在进行中。

4 影响我国抗虫转基因甘蔗产业化的主要问题和建议

经过20多年的努力，近两年甘蔗转基因研究已取得长足的进展，尤其是抗虫转基因甘蔗研制方面，2018年，巴西已经有两例抗虫转基因甘蔗投入商品化生产。然而，由于国内有关转基因基础薄弱、安全性方面的争论、政策的不确定性，致使我国转基因产业化进程进展缓漫，与发达国家相比依然有明显的差距，主要表现在以下几个方面。

4.1 转基因基础研究还有待于加强

我国抗虫转基因甘蔗的基础研究还是相对薄弱:首先甘蔗遗传转化技术体系还需加大研发力度，通过优化愈伤、诱导与分化等重要环节的质量和效率，不断完善已有的转化方法，开发转基因新技术、新方法，解决转化效率低、受体基因型依赖性强、转化周期长等问题，实现标准化、工厂化和流水线式的高效广谱甘蔗转化技术体系；其次转基因甘蔗的多抗虫性状还有待加强，通过构建大容量多元表达载体及多基因转化技术，导入多抗虫聚合基因培育多抗性高产优质安全的转基因甘蔗；最后转基因甘蔗的安全性尚需提升，通过选择更安全标记基因、甚至无选择标记、或采用双T-DNA载体结构等多项技术，全面提升转基因甘蔗的安全性。最终实现转基因甘蔗的高效、安全和规模化是甘蔗转基因研究的发展趋势。

4.2 缺乏具有自主知识产权的转基因甘蔗技术体系

由于甘蔗是无性繁殖作物，目前国内尚未建立起现代甘蔗种业，且但从外观上看无法分辨转基因甘蔗与传统品种的差别，因此转基因甘蔗商业化后必然会遇到品种的假乱杂现象，而中国小规模农户种植形式和传统物权法中“一物一权”观念将无法理清转基因甘蔗所涉及的知识产权问题。因此，中国在批准转基因甘蔗商业化种植前必须先明确其产权问题，推进转基因甘蔗的技术成果转化水平，保障转基因甘蔗基因资源的完整性，为中国转基因甘蔗产业的战略发展提供必要的保障。

4.3 缺乏完整的转基因甘蔗安全管理体系

构建转基因甘蔗的安全管理体系对转基因甘蔗的商业化应用最为重要，针对转基因甘蔗而言，其中最关键的就是转基因甘蔗信息数据库的建立。完整的转基因甘蔗信息数据库能够保障对转基因甘蔗从生产源头到消费终端之间的各个环节的全面追踪溯源，实现转基因甘蔗在产业化过程中可控制性和可监督性，同时也能够确保相关法律法规、产权信息和市场信息的公开化。根据叶颉等［2］发表的论文，转基因甘蔗信息数据库应收录以下4个方面的信息:转基因甘蔗生物学特性等相关信息、转基因甘蔗环境安全评价信息、转基因甘蔗品种的分子特征、支撑上述有关信息的参考文献等。

4.4 转基因甘蔗政策法规体系还有待于进一步优化

转基因甘蔗的开发利用周期长，政策风险高，对于政策法规有着超强的依存性。目前，尽管中国在《农业转基因生物安全管理条例》中规定了转基因生物的安全风险等级，然而各种生物的生物学特性的差异、生长、繁殖或种植、生产加工条件等各个环节都有其独特性，因此即便是同属于一个等级的生物，其产品的安全性也明显不同。此外，就转基因甘蔗而言，考虑的内容应当包括转基因甘蔗品种的审（鉴、认）定标准、转基因甘蔗种植与加工、产品销售相关规范或标准，转基因甘蔗产品的基因成分检测，有关元件如内标准基因的筛选与鉴定、相关的检测技术等，只有这样才能在保证安全和可控的前提下进行转基因甘蔗商业化应用，达到促进产业技术进步和保证环境安全、产业可持续发展的多重目标［81］。

4.5 转基因甘蔗科普宣传有待进一步加强

公众是转基因技术及其产品的最终消费者，对于甘蔗而言，消费者食用的是其加工产品蔗糖，经过高温和多次结晶后所生产的蔗糖，是不含甘蔗所有基因及其表达蛋白成分的，当然外源基因或基因表达的蛋白成分也不例外。所以只要相关知识科普到位，公众对转基因甘蔗的应用推广及其产品的接受程度是较其他直接食用的作物要高。因此需要政府、科研机构、高等院校等，定期开展转基因科普宣传、介绍转基因相关知识并公开与转基因甘蔗相关的安全评价及监管情况资料，提高社会公众对于转基因甘蔗的认知水平。