2014 年～2019 年PRRSV 主要流行毒株在我国的变化

张洪亮，张文立，许 浒，宋帅杰，赵 静，相丽润，冷超粮，李 真，刘春晓，汤艳东，陈家锃，彭金美，王 倩，安同庆，童光志，蔡雪辉*，田志军*

（1. 中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069；2. 南阳师范学院，河南 南阳 473061；3. 中国农业科学院 上海兽医研究所，上海 200241）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征的主要病原，其给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。中国大陆PRRSV CH-1a株[1]主要引起母猪的繁殖障碍，2006 年以前一直是我国的主要流行毒株。2006 年中国暴发由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引起的高致病性PRRS（HP-PRRS），该类病毒株在Nsp2 基因中存在30（1+29）个氨基酸的不连续缺失[2-3]，该类毒株致病性强，很快成为我国的主要流行毒株。2011 年，我国报道出现了I 型PRRSV[4]，然而，该毒株只是散在发生，并未发生流行[5-7]。2012 年，我国报道了与NADC30 同源性较高的PRRSV，称为NADC30-like PRRSV，这类病毒在Nsp2基因中存在131（111+19+1）个氨基酸的不连续缺失[8-9]，该类毒株基因组核苷酸同源性低、重组频繁，致病性差异较大。2015 年，我国报道出现Lineage 3 PRRSV，这类病毒在Nsp2基因中存在36 个氨基酸的连续插入[10]。近年来，该类毒株检出数量增加，主要流行于我国的华南地区。2018 年，我国报道出现NADC34-like PRRSV，这类病毒在Nsp2 基因中存在100 个氨基酸的连续缺失[11]。目前，我国的PRRSV 呈现多基因亚型并存的局面，主流毒株发生了哪些变化，本研究对此开展了研究。

1 材料与方法

1.1 病料来源及主要试剂2007 份疑似PRRSV 感染的病料采自从全国17 个省、市和自治区（黑龙江省、内蒙古自治区、吉林省、辽宁省、新疆维吾尔自治区、天津市、河北省、山西省、山东省、河南省、湖北省、江西省、安徽省、四川省、浙江省、江苏省、广东省）的养猪场。338 份疑似PRRSV 感染的病料采自山东某大型养殖集团。RNeasy plus Mini Kit 购自Qiagen 公司；AMV 反转录酶、dNTPs、LA Taq DNA 聚合酶和pMD18-T 载体等购自TaKaRa 公司，Gel Extraction Kit 购自OMEGA 公司，TG1 感受态由本实验室制备，PAM 细胞和Marc-145 细胞由本实验室保存。

1.2 引物设计根据GenBank 中的BJEU06-1（GU047344）、HuN4（EF635006）、NADC30（JN654459）、ATCC VR-2332（AY150564）、QYYZ（JQ308798）和IA/2014/NADC34（MF326985）株全基因组序列，参照文献[11-15]由库美生物有限公司合成2 对检测引物和6 套全长扩增引物（8～9 对/套）。

1.3 PRRSV 部分基因及全基因序列扩增取组织样品研磨后的上清液提取总RNA，反转录制备cD⁃NA。利用2 对检测引物进行病料样品检测，并扩增阳性样品的nsp2 和GP5 基因。利用6 套全长引物对部分阳性代表毒株进行全基因组序列的扩增。以上扩增反应程序为，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s～2 min 30 s，共30 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳，用Gel Extrac⁃tion Kit 对目的片段进行回收，纯化后的PCR 产物克隆到pMD18-T 载体中。重组克隆由库美生物有限公司进行测序。全基因组序列由MegAlign 和Seqman 进行拼接。

1.4 PRRSV 的遗传演化分析利用MegAlign 对拼接完的全基因组序列进行核苷酸的同源性分析及nsp2 和ORF5 推导氨基酸序列的分析。利用MEGA 6.0 对全基因组及部分基因进行遗传演化分析。根据GenBank 中提交的参考序列，用RDP4 软件进行重组分析，筛选出主要亲本毒株和次要亲本毒株。根据RDP4 得到的结果，利用Simplot 对PRRSV 的全基因组序列进行重组分析。同时对338 份养殖企业来源病料进行同样检测分析。

1.5 PRRSV 细胞嗜性分析取各年代具有代表性的PRRSV 阳性组织样品，研磨后收集上清液，经0.45 μm 的滤器过滤后每个样品分别接种Marc-145细胞和PAM 细胞，孵育2 h 后，用DMEM 清洗1遍，补入2 mL DMEM，2 d～3 d 后观察并收取上清，所有的样品均在Marc-145 细胞和PAM 细胞中盲传3代，按照1.3 中方法，利用鉴定引物进行PCR 检测，分析PRRSV 的细胞嗜性。

2 结果与讨论

2.1 PRRSV 的检测结果及在各省分布对2014 年6 月～2019 年8 月 采 集 的2007 份 疑 似PRRSV 感 染 的病料进行检测，结果显示，共检出PRRSV 阳性516份，其中黑龙江省、山东省、广东省和河南省的检出比率较高。选择测序365 株ORF5 基因序列、323株nsp2 基因序列和87 株全基因组序列，遗传演化分析发现，2014 年～2019 年共检测到6 种亚型的PRRSV，分别是I 型和II 型（HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV、QYYZ-like PRRSV和RespPRRS MLV-like PRRSV）。尽管本研究检测的样品数量和区域相对有限，但样品采集时间准确、地点明确，对了解我国近年来PRRSV 流行株的变化仍具有较大的参考价值。

2.2 我国PRRSV 主要流行毒株的变化对采集病料进行检测分析，结果显示，2014 年～2015 年，HP-PRRSV 的阳性占比几乎是100%，2015 年以后，HP-PRRSV 的检出比率呈现下降趋势（图1）。2015年，本研究检测到一株NADC30-like PRRSV，随后该类型毒株大面积出现，检测到的毒株数量急剧上升，该类毒株在检出数量上已明显超过HP-PRRSV，显示NADC30-like 毒株已取代HP-PRRSV 成为我国的主要的流行毒株（图1），这与其它团队对河北省和河南省PRRSV 的检测结果一致[16-17]。2014 年以前未检测到NADC30-like 毒株，而国内其他研究人员检测到了少量该类毒株，可能存在两个原因：一是本团队检测的毒株数量有限；二是该类毒株当时还不是主要流行毒株，检出率偏低。对各种类型的PRRSV的分布进行统计分析发现，我国PRRSV 的分布表现出一定地域性，NADC30-like 毒株和HP-PRRSV 具有全国流行性；QYYZ-like PRRSV 主要在我国华南地区流行；NADC34-like PRRSV 在我国刚出现，与早期的NADC30-like PRRSV 的流行比较相似，本研究已经在全国3 个省份检测到该类毒株；RespPRRS MLV-like PRRSV 在部分猪场流行；I 型PRRSV 在我国呈现散发状态。

图1 2014 年～2019 年我国PRRSV 的类型及阳性占比Fig.1 The subgenotypes and positive percentage of PRRSV during 2014 to 2019 in China

为进一步分析PRRSV 主要流行毒株的变化，对2014 年8 月～2018 年10 月 某 大 型 养 殖 集 团338 份 疑似PRRSV 感染的病料进行检测分析，结果显示，检出PRRSV 134 株。测序121 株ORF5 基因序列、118株nsp2 基因序列和35 株全基因组序列，结果显示共检测到4 种亚型的PRRSV，分别是HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、 QYYZ-like PRRSV 和Resp⁃PRRS MLV-like PRRSV。2014 年～2015 年，该 集 团HP-PRRSV 的阳性占比100%，2015 年以后，HPPRRSV的检出比率逐渐降低（图2）。相反，NADC30-like 毒株检出比率急剧上升，2018 年该类毒株在检测数量上已明显超过HP-PRRSV，显示NADC30-like 毒株已取代HP-PRRSV 成为该集团的主要的流行毒株（图2）。以上结果与本研究对全国PRRSV 的检测结果一致，进一步表明无论是大到全国，小到某集团，PRRSV 主要流行毒株的变化具有一致性。因此，我国现阶段PRRS 防控应以针对NADC30-like PRRSV 为主，同时，华南地区还应该加大对QYYZ-like PRRSV 的防控。当前，由于非洲猪瘟在我国大面积发生，养殖集团减少了包括PRRSV疫苗在内的各类疫苗的使用，随着猪场的大面积复养，生猪数量急剧增加，PRRSV 可能出现新一轮的流行。

图2 2014 年～2018 年某大规模化养殖集团PRRSV 的类型及阳性占比Fig.2 The subgenotypes and positive percentage of PRRSV in certain pig company

2.3 我国PRRSV 的基因特征及演化趋势基于nsp2 推导氨基酸序列比对发现，与RespPRRS MLV-like PRRSV 相 比，NADC30-like PRRSV 的Nsp2蛋白存在131 个氨基酸的不连续缺失；NADC34-like PRRSV 的Nsp2 蛋白存在100 个氨基酸的连续缺失；QYYZ-like PRRSV 的Nsp2 蛋白存在36 个氨基酸的连续插入；HP-PRRSV 的Nsp2 蛋白存在30 个氨基酸的不连续缺失。遗传演化分析显示，NADC30-like PRRSV 已经成为我国的主要流行毒株，该类毒株变异速度快，全基因组核苷酸同源性低，毒株之间很难找到传播的关系；NADC34-like PRRSV 在我国刚刚出现，这类毒株与NADC30-like PRRSV 有很多相似之处，它们均与美国的毒株同源性较高，刚出现时零星存在，经过短暂的几年时间NADC30-like PRRSV 已经成为我国的主要流行毒株，而NADC34-like PRRSV 的流行值得关注；我国QYYZlike PRRSV 形成了独立的分支，称为sublineage3.5，这类毒株主要流行于我国的华南地区，已有证据表明中国大陆地区的sublineage3.5 可能起源中国台湾的sublineage3.2[14,18]；RespPRRS MLV-like PRRSV 变异较小，与疫苗毒RespPRRS MLV 的序列高度同源，这类毒株极有可能与该疫苗的使用有关；HP-PRRSV的检出比率在降低，部分毒株出现了较大程度的变异，这类毒株有可能逐渐消失，这与其它团队对河南省PRRSV 的检测结果一致[17]。我国I 型PRRSV 均属于西欧I 亚型，毒株间核酸同源性较低，毒株之间很难找到遗传演化关系。重组分析结果表明，NADC30-like PRRSV 和QYYZ-like PRRSV 的出现导致我国PRRSV的重组频率大幅度提高，它们广泛与我国存在的毒株发生重组，导致当前的PRRSV 重组模式复杂多样[18]，然而这种复杂的重组模式的形成机制及对病毒的影响仍需进一步研究。

2.4 我国PRRSV 的细胞嗜性的改变对不同年份PRRSV 毒株进行Marc-145 细胞和PAM 细胞培养传代后PCR 检测，结果显示，2014 年，我国出现了感染PAM 不感染Marc-145 细胞的PRRSV（图3）。2016年，出现了PAM 和Marc-145 细胞均不感染的PRRSV，而且，这类毒株的比列占据绝大多数，只有极少部分毒株可以进行体外分离（图3）。以上结果显示我国的PRRSV 体外细胞嗜性发了变化。

图3 2014 年～2019 年PRRSV 的分离鉴定Fig.3 Isolation and identification of PRRSV during 2014-2019

为了研究PRRSV 细胞嗜性发生变化的原因，本研究团队前期构建了MY-376（感染PAM 不感染Marc-145 细胞）的感染克隆，通过与HuN4-F112（感染Marc-145 细胞）各基因片段的互换，发现GP2a-GP3 的变异影响了这类毒株对Marc-145 细胞嗜性[19]。此外，大多数的毒株是从猪的肺脏中检测到的，然而，体外PAM 细胞分离不到这类毒株。因此，PRRSV体外不感染PAM细胞的原因仍需进一步研究。

综上所述，目前我国PRRSV 呈现多种亚型并存的局面，NADC30-like PRRSV 取代了HP-PRRSV 成为了我国的主要流行毒株，QYYZ-like PRRSV 主要流行于我国华南地区，其他类型的毒株呈现散发或局部流行。当前PRRSV 的快速变异和高频率重组使我国的PRRSV 类型复杂多样，新毒株的生物学特性也发生了变化。因此，应加大对新毒株的监测和生物学特性发生变化的机制研究，为我国PRRSV 的防控提供数据支持和理论基础。