脓毒症患者外周血单个核细胞STAT3 mRNA表达及其对预后的预测价值

谢璨灿，曾维忠，吴双华，李峥嵘，黄冰

株洲中心医院，湖南株洲412007

脓毒症是一种由细菌或真菌进入血液感染人体免疫系统和凝血系统而引起的致死性综合征。多种炎症因子在巨噬细胞介导下，通过各种信号转导通路，导致炎症介质的级联式或瀑布式效应，从而加速中性粒细胞与内皮细胞黏附，激活凝血系统，最终发展为脓毒症[1～3]。脓毒症患者一旦出现脓毒症休克，病死率明显增加[4,5]。寻找特异度和敏感度更高的生物标志物作为脓毒症的早期诊断指标一直是学者们研究的重点。信号转导子和转录激活子3(STAT3)可能是脓毒症所致功能障碍的关键调控基因[6]。近年来，有关STAT3参与脓毒症机制的研究取得了一定进展[7]。研究发现，STAT3在脓毒症中异常表达，其不仅可以直接调控促炎因子和抑炎因子的表达释放，还可作用于炎症信号传导通路的其他关键分子间接调控脓毒症的发生发展。STAT1和STAT3有望作为预测脓毒症合并多器官功能障碍的新标志物[8～10]。急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)是临床上最权威的危重症病情评估系统，已广泛应用于危重症患者病情严重程度的评价[11]。本研究观察了脓毒症患者外周血单个核细胞中STAT3 mRNA的表达变化，探讨其与病情严重程度的相关性，进一步分析STAT3 mRNA对脓毒症患者预后的预测价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年1～11月株洲市中心医院收治的脓毒症患者92例(脓毒症组，男62例、女30例)以及同期入院体检的健康志愿者20例(对照组，男10例、女10例)作为研究对象。两组性别、年龄资料有可比性。脓毒症诊断符合2016年美国重症医学会和欧洲危重病医学会联合发布的最新脓毒症定义SEPSIS3.0中的诊断标准。排除住院时间少于24 h者，恶性肿瘤、先天性或继发性免疫功能缺陷性疾病患者，病历资料记录不完整者。脓毒症组入院时进行APACHEⅡ评分>30分(高危)26例、20～30分(中危)48例、10～<20分(低危)18例；28 d内存活50例、死亡42例，存活者、死亡者入院时血清降钙素原(PCT)水平分别为(31.82±41.08)、(37.15±38.25)ng/mL，血乳酸(Lac)水平分别为(2.84±2.27)、(6.26±4.74)mmol/L。本研究符合医学伦理学标准，经医院医学伦理委员会审批通过，研究方案获得患者或家属知情同意。

1.2 外周血单个核细胞STAT3 mRNA检测 脓毒症组于确诊6 h内、对照组于同时取静脉血10 mL，加入EDTA抗凝管，使用淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞，加入RNA稳定剂中保存，置于-70 ℃冰箱保存待检。以TRIzol法常规提取淋巴细胞总RNA，取少量RNA溶液，用紫外分光光度计分别测波长260、280 nm的吸光度(A)值，以A260/A280≥1.8为合格样品，获取RNA浓度值。采用TaKaRa PrimScript逆转录试剂盒，按照说明书将RNA逆转录为cDNA。依据GenBank提供的GAPDH及STAT3基因序列，采用Pmerremier5.0软件设计人源引物。内参GAPDH上游引物序列为5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′，下游引物序列为5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。STAT3 mRNA上游引物序列为5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物序列为5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′。按照SYBR Green PCR试剂盒说明书上实时定量PCR仪(AB7500)进行反应，反应条件为95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 脓毒症组外周血单个核细胞中STAT3 mRNA表达变化 脓毒症组、对照组外周血单个核细胞中STAT3 mRNA相对表达量分别为1.93±0.30、1.00±0.14，脓毒症组STAT3 mRNA相对表达量高于对照组(P<0.01)。脓毒症组中，低危、中危、高危患者STAT3 mRNA相对表达量分别为1.77±0.27、1.93±0.27、2.17±0.22，低危、中危、高危患者STAT3 mRNA相对表达量逐渐升高，两两相比，P均<0.05；存活、死亡患者STAT3 mRNA相对表达量分别为1.80±0.22、2.09±0.30，死亡患者STAT3 mRNA相对表达量高于存活者(P<0.01)。

2.2 脓毒症组STAT3 mRNA表达与APACHEⅡ评分、PCT、Lac的相关性 Pearson相关分析显示，脓毒症组外周血单个核细胞STAT3 mRNA表达水平与APACHEⅡ评分、Lac呈正相关(r分别为0.719、0.332，P均<0.05)，与PCT无关(r=-0.097，P>0.05)。

2.3 STAT3 mRNA、APACHEⅡ评分、PCT、Lac对脓毒症患者死亡的预测价值 外周血单个核细胞STAT3 mRNA相对表达量预测脓毒症患者死亡的ROC曲线下面积(AUC)为0.892(P<0.01)，最佳截断值为3.06时敏感度为81%、特异度为88%；APACHEⅡ评分预测脓毒症患者死亡的ROC曲线下面积(AUC)为0.890(P<0.01)，最佳截断值为24.5分时敏感度为81%、特异度为86%；而Lac、PCT等指标相较于前两者预测价值较小。见图1、表1。

图1 STAT3 mRNA、APACHEⅡ评分、PCT、Lac预测脓毒症患者死亡的ROC曲线

3 讨论

脓毒症的病理生理机制极其复杂，涉及一系列的炎症与抗炎过程、体液与细胞反应，以及循环系统的异常等。目前脓毒症的治疗主要采用早期液体复苏、使用血管活性药物维持血压以保证组织灌注、改善微循环、使用强效抗生素、使用激素增强血管活性药物敏感性、床旁血液净化等，如果不能纠正患者低灌注状态，则可能发生脓毒症休克，患者可出现高热、凝血功能异常、多器官功能衰竭甚至死亡。虽然近年来脓毒症休克的治疗流程和手段更加规范，患者病死率有所降低，但脓毒症的早期诊治仍有局限性，使得该病的治疗依然面临严峻挑战。

STAT3是细胞内调控炎症的主要信号通路，在脓毒症中起重要作用[12]。在脓毒症早期，大量促炎因子如IL-6、TNF-α通过STAT3通路引发炎症级联瀑布效应[13]。而有研究表明，感染性休克时血清IL-6水平持续升高，患者死亡率也会随之上升[14]。血浆IL-6和TNF-α水平均很高的败血症患者一般预后不良。Kamezaki等[15]发现LPS通过Tyk2进而激活STAT1和STAT3信号通路，引起炎症因子大量释放，进而促发感染性休克。Herzig等[16]发现STAT3活化是CLP诱导感染性休克进程中的关键，并且与炎症介质的释放和器官功能障碍密切相关。Zhao等[17，18]发现STAT3抑制剂LL2可以抑制脓毒症早期促炎因子表达，减轻炎症反应，表明STAT3信号通路激活参与脓毒症引起的炎症反应，而抑制通路活性可减轻炎症反应。有研究表明，STAT3的激活能诱导巨噬细胞对内毒素的反应性降低，这可能与脓毒症的免疫抑制机制存在关联。因此，靶向调控STAT3的表达为干预脓毒症提供了一个新的方向[19]。

表1 STAT3 mRNA、APACHEⅡ评分、PCT、Lac对脓毒症患者死亡的预测价值

APACHEⅡ评分是目前国内外较为认可的危重症病情评价系统，它是针对患者急性生理和慢性健康状况的综合评价体系，其分值越高表明患者的状态越差，死亡的可能性越大。APACHEⅡ评分能够较为全面地反映患者机体状况和评估危重患者预后[20]。脓毒症涉及的生物标志物种类繁多。有学者[21]估算文献报道的有关脓毒症的生物标志物超过178种，目前应用最广泛的为PCT。脓毒症经目标导向治疗后，PCT值下降通常提示患者预后改善，如果PCT值维持原水平或较前升高则提示患者预后不佳。PCT对脓毒症预后的判断具有一定的参考价值[22]。血清Lac检测通常被纳入危重疾病的临床管理，特别是在严重脓毒症和脓毒症休克的情况下。血清Lac水平升高被认为是组织缺氧的标志，通常在临床上用作评价脓毒症严重程度和预后的指标。高浓度的血清Lac可能是患者死亡的预测指标，而Lac水平降低与预后改善有关[4,23,24]。

本研究观察了脓毒症患者外周血单个核细胞中STAT3 mRNA表达变化，结果发现脓毒症组STAT3 mRNA相对表达量高于对照组；脓毒症组中，低危、中危、高危患者STAT3 mRNA相对表达量逐渐升高，死亡患者STAT3 mRNA相对表达量高于存活者；脓毒症组外周血单个核细胞STAT3 mRNA表达水平与APACHEⅡ评分、Lac呈正相关，与PCT无关。这表明脓毒症患者STAT3 mRNA表达水平升高，且可能与患者的病情严重程度和预后有关，STAT3表达水平高的脓毒症患者预后较差，死亡风险较高。进一步分析STAT3 mRNA及其他常用指标对脓毒症患者预后的预测价值，结果显示，外周血单个核细胞STAT3 mRNA相对表达量预测脓毒症患者死亡的AUC为0.892，最佳截断值为3.06时敏感度为81%、特异度为88%；APACHEⅡ评分预测脓毒症患者死亡的AUC为0.890，最佳截断值为24.5分时敏感度为81%、特异度为86%。这表明STAT3 mRNA相对于其他指标对脓毒症患者死亡有更好的预测价值。

综上所述，脓毒症患者外周血单个核细胞中STAT3 mRNA相对表达量升高，与患者APACHEⅡ评分及28 d内预后有关；检测脓毒症患者外周血单个核细胞中的STAT3 mRNA有助于反映疾病严重程度并预测预后。STAT3有望成为脓毒症早期诊断和治疗评估的关键性指标。然而本研究尚存在一定局限性，由于脓毒症休克患者病情危重，未能收集更多样本信息，之后研究应纳入更多患者，以验证上述结论。