血清微小RNA-433和转化生长因子-β1在扩张型心肌病合并慢性心力衰竭患者中的变化及临床意义

杜春书 王军 黄佩花 吴多省 陈梦飞

心力衰竭(简称心衰)是各种器质性心血管疾病的终末期阶段，血流负荷过重或由心肌梗死引起心脏重构是心衰的主要病理生理基础[1]。既往研究证实，转化生长因子(TGF)-β1介导的信号通路自心肌代偿性肥大至心衰发生各阶段均发挥重要作用[2]。近年来，随着分子生物学的研究进展，微小RNA(miRNA，miR)在心衰发生、发展过程中的作用越来越受到重视[3]。Espinosa-Diez等[4]研究发现，miR-433通过反馈性放大TGF-β1/Smad3-Azin1信号通路促进肾脏纤维化。我们通过分析扩张型心肌病(DCM)合并慢性心衰(CHF)患者血清miR-433和TGF-β1水平变化及其与心功能的相关性，旨在为miR-433和TGF-β1在心衰发生、发展中的作用机制研究提供理论依据。

对象与方法

1.对象：2017年8月～2019年2月于海南省东方市东方医院和海南医学院第一附属医院心血管内科确诊并接受治疗的DCM合并CHF患者106例(DCM合并CHF组)，其中男67例，女39例，年龄37～81岁，平均年龄(62.1±12.0)岁，纽约心脏病学会(NYHA)心功能Ⅱ级33例，Ⅲ级47例，Ⅳ级26例。同时选取100例健康体检者作为对照组，其中男60例，女40例，年龄34～80岁，平均年龄(60.3±13.5)岁。纳入标准：(1)符合《中国心肌病诊断与治疗建议》[5]关于DCM的诊断标准[心脏扩大：左心室舒张末期内径(LVEDd)>5.5cm(男性)或>5.0cm(女性)；左心室射血分数(LVEF)<45%]；(2)符合欧洲心脏病学会关于CHF的诊断标准[6]；(3)NYHA心功能分级Ⅱ～Ⅳ级[7]；(4)有明确的基础心脏病史。排除缩窄性心肌炎、心包炎、家族性DCM、自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、急慢性感染、外伤及长期大量吸烟、饮酒、滥用药物者。本研究经海南省东方市东方医院和海南医学院第一附属医院医学伦理委员会审核批准，所有受试者均签署知情同意书。

2.方法

(1)血清miR-433水平检测：采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-433水平。抽取两组受试者空腹肘静脉血2 ml,加入乙二胺四乙酸抗凝，离心取上清液，采用Trizol and miRNeasy mini试剂盒(德国Qiagen公司)提取总RNA，并对其进行质检，若A260 nm/A280 nm为1.8～2.1，则质检合格。采用miScript Ⅱ RT kit(50)(德国Qiagen公司)和SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ(中国TaKaRa公司)进行逆转录反应。miR-433茎环逆转录引物(上海生工生物工程有限公司)序列为5’-CGT GGT GAA CCT CCG TTT TAC CCG GTC TAA TGA GGA GGG CCC TAT GTC GAA TCC CCC GAT GGG -3’；miR-433扩增上游引物为5’-GTA CGG GCA AAT AAC CCC CGA GTC GC-3 ’，下游引物为5 ’-CCT GCC GTA TGG GTA CGT GCC AT-3’，以小分子U6作为内参，反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s共45个循环。以2表示miR-433相对表达水平。

(2)血清TGF-β1水平检测：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组受试者血清TGF-β1水平，ELISA试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司。

(3)生化指标检测：采用Cobas e411全自动电化学发光免疫分析仪(瑞士罗氏)检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)、氨基末端B型钠尿肽前体(NT-proBNP)等。采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖(FPG)和餐后2 h血糖(2 h PG)。

结 果

1.两组受试者一般资料和临床资料比较：两组受试者性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史及FPG、2 h PG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，而DCM合并CHF组患者血清miR-433和TGF-β1水平均高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组受试者一般资料和临床资料比较

2.DCM合并CHF组患者血清miR-433与TGF-β1水平的相关性分析：Pearson相关分析结果显示，DCM合并CHF组患者血清miR-433与TGF-β1水平呈正相关(r=0.302，P<0.001)，见图1。

图1 DCM合并CHF组患者血清miR-433与TGF-β1水平的相关性分析

3.不同NYHA心功能分级的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比较：NYHA心功能Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着NYHA心功能分级的增加，其血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEDd逐渐升高，LVEF逐渐降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同NYHA心功能分级的DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEF、LVEDd比较

4.DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平与心功能的相关性分析：Spearman等级相关分析结果显示，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均与NYHA心功能分级呈正相关(rs=0.576、0.473，P均<0.001)。Pearson相关分析结果显示，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均与NT-proBNP(r=0.455、0.410，P均<0.001)、LVEDd(r=0.388、0.372，P均<0.001)呈正相关；而血清miR-433和TGF-β1水平与LVEF呈负相关(r=-0.420、-0.365，P均<0.001)。

5.DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1与心功能分级的关系：将NYHA心功能分级(Ⅲ～Ⅳ级)作为因变量，赋值为1，分别将血清miR-433和TGF-β1水平以连续变量纳入logistic回归方程，未校正混杂因素时，血清miR-433和TGF-β1均是DCM合并CHF患者NYHA心功能分级进展的影响因素(P<0.05)；校正各项混杂因素后，血清miR-433和TGF-β1仍是DCM合并CHF患者心功能损伤加重的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1与心功能分级关系的多因素logistic回归分析

讨 论

DCM以心室异常扩张、心室壁变薄、心肌纤维化等为主要病理表现。根据指南推荐，DCM的治疗原则为阻止或延缓心肌损伤进程[8]，因此，亟需针对心肌纤维化和心室重构的研究。Cho等[9]的研究结果显示，TGF-β1可促进心肌成纤维细胞活化并向肌成纤维细胞分化，进而导致细胞外基质大量沉积。Chen等[10]的研究结果显示，通过抑制大鼠TGF-β1基因表达后，心脏TGF-β1水平明显降低，进而抑制其心室重构，延缓心衰的发生，因此推测TGF-β1及其调控通路有望成为抗心肌纤维化治疗的重要靶点之一。但Heldin等[11]却发现抑制TGF-β1表达虽能抑制心肌纤维化，改善心肌细胞功能，但却加剧了左心室扩张和炎症反应，因此，TGF-β1在心衰不同的发展阶段可能发挥着不同作用，针对TGF-β1的抑制剂用于心衰的治疗尚存在争议。

心脏中的TGF-β1主要是由心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞分泌，TGF-β1反过来又可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。既往有研究证实，在心肌细胞中转染特定的miRNA可改善或损伤心肌功能，影响心力衰竭的进程。李军等[12]的研究结果显示，敲除小鼠miR-1252基因表达后，其心肌纤维化程度明显加重，同时TGF-β1表达水平升高。而史晓婧等[13]的研究证实，转染miR-808后，大鼠成纤维细胞TGF-β1水平明显降低，进而改善心肌梗死后心肌纤维化的程度。miR-433定位于12号染色体，在肿瘤领域中的研究较为深入。陶丽婵等[14]通过建立DCM小鼠模型，发现其miR-433表达水平明显升高。Li等[15]发现miR-433在纤维化肾脏组织中的表达水平明显上调，随后证实miR-433可能通过促进TGF-β1/Smad3信号通路激活进而促进肾脏纤维化进程。

本研究结果显示，DCM合并CHF患者血清miR-433水平高于对照组，且与TGF-β1水平呈正相关。目前对于CHF的诊断和分层主要依据心脏超声、脑钠肽、NT-proBNP、心肌损伤标志物等，除此以外，近几年陆续发现了一些炎症类(如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α)或代谢类(如胰岛素样生长因子结合蛋白-7)心肌功能生物标志物，但提供的信息均有限，尚未发现可反映心衰进展和心肌纤维化程度的标志物，因此，从miRNA水平探索新的标志物对于临床精准治疗具有重要价值。本研究中，随着NYHA心功能分级的增加，DCM合并CHF患者血清miR-433、TGF-β1、NT-proBNP水平及LVEDd逐渐升高，LVEF逐渐降低，提示miR-433在DCM合并CHF的发生及病情进展过程中发挥重要作用，且血清miR-433与TGF-β1水平呈正相关，表明二者之间可能存在某种调控关系；同时血清miR-433、TGF-β1水平均与NT-proBNP、LVEDd、LVEF密切相关，表明在DCM合并CHF患者中，miR-433也可能参与心肌纤维化和心室重构；多因素logistic回归分析结果显示，校正各项混杂因素后，血清miR-433和TGF-β1均为DCM合并CHF患者心功能损伤加重的独立危险因素。

综上所述，DCM合并CHF患者血清miR-433和TGF-β1水平均高于正常对照者，且均与NYHA心功能分级呈正相关，同时miR-433和TGF-β1也存在一定联系，但其具体机制尚未明确，血清miR-433和TGF-β1是否可用于心衰的危险分层、作为潜在心衰的治疗靶点仍需进一步探讨。