蛹虫草的抗氧化性和热稳定性及归经作用研究

饶平凡 陈 汉 周河美 陈瑞琛 骆梅香 陈 琦 许明明 郭静科 柯李晶*

（1 中国科学院上海生命科学研究院-浙江工商大学食品营养科学联合研究中心 杭州 310035 2 福州大学生物工程研究所 福州350002 3 厦门元尊生物工程有限公司 福建厦门361026 4 泉州师范学院海洋与食品学院 福建泉州362000 5 福州大学至诚学院食品与生物工程系 福州350002）

蛹虫草 （Cordyceps militaris） 又称北冬虫夏草，属子囊菌门、麦角菌科、虫草属，具有补肺益肾[1]，抗衰老，增强免疫，促进代谢的作用，有很高的食用价值[2]。蛹虫草含有多糖、虫草酸、氨基酸、虫草素、超氧化物歧化酶等生物活性物质，而这些物质都有很好的抗氧化性[3-4]。研究表明，蛹虫草能提高老龄大鼠SOD、GSH-Px 活性，明显降低LPO含量，其抗衰老能力优于VE[5]。对神经性中毒的PC12 细胞能通过降低线粒体中的细胞色素c、细胞MDA 含量和胞内自由基水平，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px 活性，起到保护作用[6]。蛹虫草的诸多功效可能与其抗氧化活性有关。此外，常用的蛹虫草烹饪方式为煲汤，而加热会对抗氧化活力有破坏作用，因此蛹虫草的热稳定性值得研究。

食物对人体脏腑、经络的选择，即通常所说的“归经”。因食物不同，归经也不同[7]。饮食对于人体正常生命活动必不可少[8]，食物性味归经很难用一种简便而且客观的方式加以定量，在前期研究过程中，发现人体的经络电压变化和抗氧化密切相关[9]，因此采用监测经络电压的方法，客观评价多种食品的摄入对人体不同经络的影响[10]。生物体的自由基分布与经络重合[11]，可以通过对特定经络进行抗氧化治疗以达到降低单纯性肥胖患者的体重[12-13]和改善过敏性鼻炎症状[14]的效果。在此基础上，应用经络电压监测方法探究蛹虫草的归经特质，从食品角度探讨人体经络电压检测方法监测氧化应激状态的可能性。同时，对蛹虫草进行体外总抗氧化力检测和SOD 活力检测分析，多角度对比分析蛹虫草的抗氧化性对机体氧化应激处理系统的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

1.1.1 蛹虫草 蛹虫草片，厦门元尊生物工程有限公司。由高虫草素虫草菌株 （菌种保藏编号：FY1421）经培养、烘干、超微粉碎、灭菌、压片、包装制成，其有效成分虫草素含量为6 000 μg/g。

1.1.2 SOD SOD，福州大学生物工程研究所。将构建好的含有TAT-SOD 基因的高表达克隆接种于100 mL 含50 μg/mL Amp 的LB 培养基中，37℃摇培过夜；菌液按2%接种量接种于1 000 mL新鲜的LB 培养基中（含50 μg/mL Amp），37 ℃摇培到OD600=0.6～0.8，加入IPTG 至终浓度为250 μmol/L，CuSO4500 μmol/L，ZnSO4100 μmol/L，25℃振摇诱导培养6 h；菌液5 000 r/min 离心15 min，收集菌体，用100 mL PBS 重悬，冰浴中超声破碎30 min，12 000 r/min 离心10 min，上清液用0.22 μm 膜过滤备用。上清液经过GST 融合蛋白亲和色谱柱提纯获得SOD 蛋白。所获得SOD蛋白比活力＞50 000 U/g[15]。

1.1.3 样品的制备 原样：准确称取蛹虫草片、SOD 含片，分别用pH 7.2 的磷酸缓冲液以料液比1∶30 进行溶解，再用37 ℃，800 r/min 水浴恒温搅拌器浸提1 h，完成后，将混合液超声20 min，放置4 ℃冰箱，静置过夜24 h，用离心机以25 ℃，5 000 r/min，离心15 min，取上清液，作为待测样品。

煮沸4 h 的样液：100 ℃水浴4 h，冷却至室温，用离心机以25 ℃，5 000 r/min，离心15 min，取上清液，作为待测样品。

1.1.4 主要试剂和仪器 SOD 试剂盒 （T-SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒，南京建成生物工程研究所。Ag/AgCl 一次性使用心电电极，上海钧康医用设备有限公司。多通道生理信号采集处理系统（RM6240C），成都仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的抗氧化活性检测 样品的总SOD活力与总抗氧化能力（T-AOC）通过相应试剂盒测定。

1.2.2 实验对象 20 名健康志愿者在知情同意后进行实验。参加实验的受试者需要符合以下要求：1）年龄：20-30 岁；2）既往无肾、肝、心血管疾病或者其它严重器质性疾病；3）无饮酒、抽烟、滥用毒品等不良嗜好；4） 有规律性作息时间（晚上12 点前入睡）；5）没有长期的药物治疗；6）在实验前一个月内，没有经历过针灸、按摩等穴位干扰行为。这个研究获得中国科学院上海生命科学研究院-浙江工商大学食品营养科学联合研究中心伦理委员会认可。

1.2.3 实验分组 志愿者经招募后，随机分为2组，每组10 人，分别服用蛹虫草片和SOD 蛹虫草片。

1.2.4 实验方案 选择肺经、肾经、肝经和脾经的合穴和原穴（表1）作为经络电压的测量点，分别以合穴为正极，原穴为负极。所有实验对象在第0天进行经络电压的测量，后开始分别服用蛹虫草片（1 g）和SOD 蛹虫草片（SOD 1 g，蛹虫草片1 g），持续服用14 d，第14 天再测量经络电压。测量前实验对象需仰卧在床上并保持清醒状态，然后让其深呼吸安静下来。穴位的选择和确定参照GB/T12346[16]，将测量穴位点附近毛发修剪，用医用酒精进行擦拭，等其挥发后，按标准寻找出穴位。使用Ag/AgCl 一次性心电电极贴粘贴穴位处，连接电极和数据采集表，开始采集数据。

表1 经络电压的测量点Table 1 The selected acupuncture points

1.3 数据处理方法

采用SPSS for windows 13.0 统计软件进行数据分析，测定样本结果以平均数±标准差（±s）表示。组间比较采用两独立样本t 检验，计数资料采用卡方检验或秩和检验。P＜0.05 表示结果差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草和SOD 的抗氧化活性检测结果

蛹虫草片和SOD 含片的SOD 活力分别达到2 413 U/g 和2 706 U/g（图1a），说明蛹虫草的SOD含量非常丰富，其SOD 活力与SOD 含片相当，与文献[17-18]报道结果相接近，能达到清除超氧自由基的功效。

煮沸4 h 后，蛹虫草片的SOD 活力为1 760 U/g，损失了37%，而SOD 含片的SOD 活力仅剩下85 U/g，损失了97%，意味着蛹虫草的SOD 活力能够抵抗加热过程中的破坏作用。有研究表明，丝状真菌的Cu，Zn-SOD 具有潜在的额外修饰基团和多聚体，对热稳定性较高[19]，在酸碱度为7～8 范围内SOD 的酶活性比较稳定[20-21]，而Cu，Zn-SOD 是蛹虫草体内的主要SOD，占90%以上[18，22]。SOD 含片的体系相对单一，在煮沸过程中可能没有额外修饰基团和多聚体对SOD 进行保护，导致大量SOD 酶失活，是SOD 含片的SOD 活力下降的原因之一。

蛹虫草片和SOD 含片的总抗氧化能力达到2 141 U/g 和187 U/g（图1b），蛹虫草的总抗氧化能力远超于SOD 含片，而SOD 活力却相当，这是因为所测总抗氧化能力是通过将Fe3+还原成Fe2+，不局限于针对超氧自由基。蛹虫草体系复杂，除含有SOD 酶外，还含有多种抗氧化物质，如：多糖、虫草酸、氨基酸、虫草素等[4]。而SOD 含片只有SOD 酶具有抗氧化能力，只针对溶液中少量的自由基，SOD 酶活测定针对的是SOD 酶和黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生的大量超氧阴离子自由基发生反应，这也是导致SOD 含片抗氧化能力远低于其SOD 活力的原因。

煮沸4 h 后，蛹虫草片和SOD 含片的总抗氧化能力分别为1 588 U/g 和17 U/g，分别减少了35%和91%。表明蛹虫草的抗氧化能力热稳定性好。

图1 蛹虫草片与SOD 含片的抗氧化活性检测结果Fig.1 The anti-oxidative capacity of Cordyceps militaris and SOD

2.2 蛹虫草对经络电压的影响

通过比较肾经、肺经、脾经和肝经的经络电压检测结果（图2），相对于肺经、脾经和肝经（图2b，2c），服用蛹虫草片和SOD 蛹虫草片主要体现在能显著降低肾经的电压（图2a）。这意味着长期服用蛹虫草可以减轻肾脏的氧化应激水平。SOD 蛹虫草片组的志愿者每日服的1 g 蛹虫草和1 g SOD 片，所提供的SOD 活力为5 119 U，总抗氧化活力为2 328 U，是蛹虫草片组每日服用1 g 蛹虫草提供的SOD 活力的2.1 倍，总抗氧化力的1.1倍，14 d 后SOD 蛹虫草片组的志愿者的肾经电压降低15 mV，也是蛹虫草片组的2 倍。这意味着一方面，肾经电压降低的幅度与每日所服的SOD 活力相关，另一方面，SOD 与蛹虫草混合服用，能够进一步加强这样的作用。

陈育等[23]通过对腺嘌呤致肾阳虚证小鼠影响的实验研究，发现蛹虫草对腺嘌呤致肾阳虚小鼠有一定的防治作用。李冰等[1]发现蛹虫草对糖尿病大鼠肾脏病程发展有抑制作用。杨延存等[24]发现蛹虫草能显著防止糖尿病肾病大鼠肾小球肥大，降低mAlb 与NAG 排泄率，降低肾小管内溶酶体数量，减轻肾小管的肿胀程度，保护肾小管刷状缘结构。氧化应激对肾脏具有非常关键的影响作用[25]，经络电压的测试结果与以上描述吻合。

人体经络的物质基础是结缔组织[26]，连带其中的血管、神经丛和淋巴管等交织而成的复杂体系。研究发现，结缔组织被认为是有可能成为一种尚未确认的新的系统[27]。穴位上的结缔组织含有丰富的成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、浆细胞、脂肪细胞、白细胞和未分化的间充质细胞[28]，且具有高电导，低电阻，传导速度快，特异性强的特点。穴位和经络系统包含了关于生物体真实状态的大量信息。

图2 蛹虫草片与SOD 蛹虫草片对人体肾经（a）、肺经（b）、脾经（c）和肝经（d）经络电压的影响Fig.2 The effects on electric potential difference of kidney （a），lung （b），spleen （c） and liver （d） meridian by Cordyceps militaris and SOD

3 结论

蛹虫草的SOD 活力和抗氧化能力很强，且耐高温、性质稳定。受试者服用蛹虫草片和SOD 蛹虫草片主要体现在对肾经的影响，减少肾经的氧化应激水平，这与已报道的蛹虫草的功效描述基本吻合。以上结果进一步说明通过测量经络穴位电压能在一定程度上反映蛹虫草对人体的作用，测量经络电压能够作为一种新的安全、快速、无创伤的手段，客观评价食品对人体的功效作用，为评价食品功效和新食品的开发提供一个全新视角，揭示了食品除提供营养和能量外，还具有调节人体氧化应激处理体系的作用。