基于TMR磁传感器的黄曲霉毒素B1定量检测方法研究

牛群峰，赵旭燕，惠延波，王 莉，周 潼，刘任波

河南工业大学 电气工程学院，河南 郑州 450001

在所有真菌毒素中，黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性、致癌性、致畸性均居首位，所以对食品中AFB1的含量有严格限制[1]。国标规定AFB1在花生、玉米及其制品中的限量为20.0 μg/kg，在大米和食用油(除花生、玉米外)中的限量为10.0 μg/kg，在粮食、豆类、发酵食品及调味品中的限量为5.0 μg/kg，在乳制品及婴儿配方食品中的限量为0.5 μg/kg。

目前常用的AFB1检测方法主要有仪器分析法与免疫分析技术。仪器分析法一般使用荧光检测技术，具有较高的特异性和灵敏度，但是需要复杂的提取净化步骤，且需要专业人员操作，周期较长，不适合大量样品检测。免疫分析技术基于抗体抗原相互结合原理，使用胶体金颗粒等作为标记物，可快速简便检测样品，但只能实现定性或半定量检测，灵敏度较低[2-4]。磁性免疫层析试纸是近年来新兴的一种免疫分析技术，它以超顺纳米磁珠作为标记物，通过检测磁性标记物来实现对样品的定量检测。由于粮油样品自身几乎不具有磁信号[5]，相比荧光检测等常规光学检测技术，磁检测技术可减少粮油生物组织背景噪声，并且磁检测与磁性层析技术相结合，可简化样品前处理步骤，缩短检测时间，更适用于即时现场检测。

磁检测技术包括磁感应技术[6-7]、磁传感器如巨磁电阻(GMR)传感器[8-9]、各向异性磁电阻(AMR)传感器[10-11]等，它们利用超顺纳米磁珠的磁特性来检测磁珠含量[12]。AMR传感器是最早出现的磁阻传感器，它的磁电阻率变化较小，在检测弱磁场时会受到限制。GMR传感器在弱磁场下具有较高的灵敏度，适合检测纳米磁珠[13]，但基于GMR传感器的检测一般为接触式片上检测，抗体被固定在传感器表面，不利于重复利用，且成本较高。隧道磁阻(TMR)传感器是一种新型磁阻传感器，其原理是基于自旋相关隧穿效应，传感器的电阻会随外加磁场而改变[14]，它具有比GMR传感器高得多的磁阻比以及更低的能耗，且可实现非接触式测量[15]，在磁检测方面有更好的应用前景。

1 检测原理

1.1 磁性层析试纸

如图1所示，磁性层析试纸包括样品垫、结合垫、NC膜、吸收垫、PVC板及应用于试纸条上的各种试剂，结合垫上带有已偶联抗体的免疫磁珠，NC膜上划有检测线(T线)和质控线(C线)。由于黄曲霉毒素为小分子量分析物，只有一个抗体结合点位，层析试纸采取免疫竞争法制备。当待测样品中含有AFB1时，AFB1与免疫磁珠上的单抗结合，从而抑制免疫磁珠单抗与T线上的AFB1抗原结合，因此结合在T线上的免疫磁珠较少，T线不显色，结果为阳性；当待测样品中不含AFB1时，免疫磁珠上单抗与T线上的AFB1抗原结合，T线显色，结果为阴性。无论检测样品中是否含有AFB1，免疫磁珠均会随层析作用到达C线，并与C线上二抗结合聚集在C线，C线显色。

图1 磁性层析试纸结构示意图

1.2 T线磁珠响应信号模型分析

磁性纳米粒子具有超顺磁性，即无外磁场时，通常不会表现出磁性，如果施加外磁场，会被磁化产生响应磁场。外部施加匀强激励磁场，垂直于试纸的表面。如图2所示，假设聚合在T线上的磁珠分布均匀，且T线在y轴方向的长度比x轴方向的宽度2 d大得多，可将T线等效为一个长矩形，产生的响应磁场可以用线磁偶极子模型来进行预测[16-17]。

图2 T线磁珠响应信号模型分析

线磁偶极子由两条极性相反、线磁荷密度ρm相等、间距为2d的无限长磁荷线组成，假设正磁荷线在与它相距r1的P点产生的磁场为：

(1)

式中：μ0为真空磁导率。负磁荷线与P点相距为r2，则负磁荷线在P点产生的磁场为：

(2)

两线在P点产生的磁强为上两式的矢量和，在x、z方向的分量分别为：

(3)

(4)

由式(3)、(4)可知，T线磁场强度是T线宽度、磁荷密度的函数。当T线宽度一定时，结合在T线上的磁珠越多磁荷密度越大，产生的场强就越大。使用磁传感器检测T线磁场强度，可定量检测T线磁珠，最终实现样品定量分析。

1.3 优化提离距离

由于外加激励磁场为矢量场，检测的位置和方向对结果有很大影响[18-19]，传感器的检测位置，即检测传感器与被测材料表面的距离被称为传感器的提离距离。设置提离距离分别为1、2、3、4 mm，仿真结果如图3所示。很明显，提离距离越小，信号越强，为方便操作，选择h=2 mm为最优提离距离。

图3 不同提离距离下T线磁珠响应信号

2 检测系统设计

基于TMR磁传感器的黄曲霉毒素B1检测系统设计如图4所示：使用一块C型电磁铁，线圈匝数为1 743匝，横截面积为40 mm×20.5 mm，气隙宽度为8 mm。线圈连接直流电控制模块，为C形电磁铁提供直流电流，使C形电磁铁磁化，在气隙中产生匀强激励磁场，最中心1/4面积磁强均匀性大于96%。将磁性层析试纸放入C型磁铁气隙中，垂直于激励磁场，并沿x轴方向移动。TMR传感器平行于试纸放置，且提离距离为2 mm，依次检测C线和T线上磁珠产生的响应信号，经USB数据传输模块将数据传递给上位机软件。

图4 检测系统实验平台设计

3 试验及结果分析

3.1 制备磁性免疫层析试纸

PM-020超顺纳米磁珠(180 nm)购自上海奥润公司；AFB1、抗体抗原及样品垫、结合垫、NC膜、PVC板等均由联合益康北京生物科技有限公司提供。磁珠混匀清洗过后加入偶联剂与抗体，振荡反应2 h，洗涤后4 ℃保存。预处理样品垫、结合垫、NC膜，37 ℃烘干，结合垫上喷涂偶联抗体的免疫磁珠，37 ℃干燥1 h，NC膜上喷涂BSA-AFB1为T线，羊抗鼠IgG为C线，37 ℃干燥1 h。将上述材料依次交叠2 mm粘贴在PVC板上，使用划膜仪划为4 mm宽的试纸条，密封待用。

3.2 样品检测结果分析

稀释AFB1标准品，质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20 ng/mL，将样品液滴加到试纸条上，反应6 min，结果见图5，阴性结果的T线、C线比较清晰，随样品中AFB1质量浓度的升高，T线逐渐变淡。磁性层析试纸能有效显示样品中AFB1含量的变化。

图5 不同质量浓度样品层析结果

使用检测系统测量层析试纸T线和C线磁信号，图6(a)为1 ng/mL样品1次测量值与5次测量平均值的对比，它们的完美重叠表明了系统测量的可重复性。将0.01、1、10 ng/mL的输出信号归一化如图6(b)所示，10 ng/mL的层析T线几乎不显色，测量结果超出了视觉极限。磁性层析试纸结合垫喷涂的免疫磁珠浓度对系统检测信号有较大影响，增加磁珠浓度，可提高系统检测限。

注：a为同一质量浓度样品检测结果； b为不同质量浓度样品检测结果。

以T/C值为参考量，分析其与AFB1样品含量关系，绘制标准曲线，估计检测极限，图7显示了不同质量浓度样品的检测结果。y轴为输出信号的T/C值，图7(a)中x轴对应于样品质量浓度，图7(b)中x轴为样品质量浓度的对数。由图7(b)可知，传感器输出的信号T/C值与AFB1样品质量浓度的对数呈线性关系，R2=0.988 7，在0.01～10 ng/mL范围内线性相关良好，该检测范围符合国标对AFB1的限量标准。虽然标准曲线的线性检测范围较窄，但检测系统完成一次测量所需时间仅为40 s，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。

4 结论

提出了基于TMR磁传感器和磁性层析试纸的黄曲霉毒素B1定量检测方法，搭建了检测系统实验平台，实现了黄曲霉毒素B1的定量检测。该系统操作简便，测量1次时间约40 s，与现有的检测方法相比，缩短了检测时间，提高了检测效率，可用于即时现场检测，且该系统可与多重检测磁性层析纸结合实现多目标快速检测。