玉米中4种交链孢霉毒素的测定方法研究

苏 爽，张二鹏，韩月哲，张榕杰*，韩华云，贺 静

1.郑州大学 化学学院，河南 郑州 450001

2.河南省疾病预防控制中心，河南 郑州 450016

交链孢霉毒素是由交链孢霉产生的一类真菌毒素，主要包括细交链孢菌酮酸(TeA)、交链孢酚(AOH)、交链孢酚单甲醚(AME)和腾毒素(TEN)。近年来对交链孢霉毒素的研究表明其对人畜的健康均有影响：TeA可引起急性毒性，微克剂量可引发鸡胚胎死亡，且与非洲血液病有关；TEN可使多种植物产生萎黄病；AOH和AME具有遗传毒性，可能导致细胞诱变及转化[1-3]。韩小敏等[4]通过对人食管上皮细胞Het-1 A的体外毒性研究发现，这4种毒素可通过抑制细胞增殖引起细胞凋亡。

目前，国内外还没有食品中交链孢霉毒素的限量标准和相应的标准检验方法[5]，但是在小麦、蔬菜、水果及其制品中均检出了该类毒素[6-8]。安徽省新收割的小麦籽粒中交链孢霉毒素TeA检出率为100%，最大检出的含量为3 330.7 μg/kg[9]；在番茄酱和番茄汁中TeA检出率为100%，在柑橘汁中也检出TeA和AME[10]；在市售的新鲜樱桃和樱桃酱中4种毒素均有检出，新鲜樱桃中TeA最高含量为236.58 μg/kg[11]。随着全球气候的加速转变以及环境污染的加重，粮食作物等受到真菌污染的概率越来越大，霉菌污染粮食已经成为全球性的问题[12]。玉米是三大主粮之一，我国已经成为全球玉米第二生产大国[13]。玉米作为畜禽饲料的主要原料，其生产安全在动物性食品供应中起到关键作用。目前对玉米毒素的研究主要集中于黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮，对交链孢霉毒素的研究较少，因此建立相应的检测方法并对玉米及其相关食品的安全进行调查非常重要。

交链孢霉毒素的测定方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱串联质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法[14-17]。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)具有更高的分离能力、选择性和灵敏度，近年来受到广泛关注。作者通过超高效液相色谱-串联质谱法结合固相萃取前处理技术，建立了玉米中4种交链孢霉毒素(TeA、AOH、TEN和AME)的测定方法，研究了不同淋洗液与洗脱液的组合对目标化合物加标回收率的影响，并用于实际样品测定。

1 材料和方法

1.1 材料

TeA、AOH、TEN、AME标准品溶液购自ROMER Labs，规格分别为100.9、100.3、100.5、100.3 mg/L乙腈溶液；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂为分析纯，试验用水均为超纯水。

玉米粒(10份)、玉米面(10份)、玉米糁(17份)、玉米碴(10份)购自郑州市超市及农贸市场，采集时间为2018年10月。采样后用研磨机粉碎、过筛，置于-20 ℃下避光保存，待测。

1.2 仪器与设备

LC-30 A超高效液相色谱仪：日本Shimadzu公司；QTRAP 6500三重四极杆串联质谱仪：美国AB SCIEX公司；Multi Reax振荡器：德国Heidolph公司；SORVALL LYNX 6000高速落地离心机：美国Thermo Fisher公司；N-Evap 112氮吹仪：美国Organomation公司；Milli-Q A10 超纯水器：美国Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg，6cc)、XBridge BEH C18色谱柱：美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取5 g(精确至0.01 g)待测样于50 mL离心管中，加入25 mL提取液(V0.05 mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH3.0)∶V甲醇∶V乙腈=45∶10∶45)，涡旋30 s后振荡提取60 min。4 ℃低温离心(10 000 r/min)，取上清液5 mL加入15 mL磷酸二氢钠缓冲液稀释，混合均匀，离心，待净化。HLB固相萃取柱预先用5 mL甲醇和5 mL水活化，将样品稀释液全部过柱，用5 mL 20%甲醇水溶液淋洗，抽干后用6 mL含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,体积比)混合液洗脱小柱。洗脱液在40 ℃的氮气流下吹至近干，残渣用1 mL 10%甲醇水溶液复溶，涡旋30 s后，离心，上清液供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 标准工作溶液的配制

标准工作曲线：准确移取适量标准品储备溶液，用乙腈配制成TeA、AOH、TEN为500 μg/L，AME为50 μg/L的混合标准溶液，最后用10%甲醇稀释配制系列标准溶液，TeA、AOH、TEN质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，AME质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L。

基质匹配工作曲线：取阴性玉米样品，用1.3.1方法处理得到空白基质溶液，取适量混合标准溶液，用空白基质溶液稀释配制基质匹配工作曲线，其中TeA、AOH、TEN质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，AME质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L。

1.3.3 液相条件

色谱柱：XBridge BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流速：0.5 mL/min；流动相(A)1.0 mmol/L碳酸氢铵水溶液和(B)甲醇；梯度洗脱：0～1.0 min，5%B；1.0～1.5 min，5%-75%B；1.5～2.0 min 75%-90% B；2.0～4.0 min，90%B；4.0～4.2 min，95%-5%B；4.2～9.0 min，5%B。

1.3.4 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源，负离子模式(ESI-)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化电压：-4 500 V；气帘气(Curtain Gas)：241.3 kPa；温度：550 ℃；喷雾气(Gas1)：344.7 kPa；辅助加热气(Gas 2)：413.7 kPa；碰撞气：Medium。4种交链孢霉毒素的质谱参数见表1。

表1 交链孢霉毒素的质谱采集参数

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

TeA是一元酸类化合物(pKa=3.5)，与AOH和AME极性相差较大，需要选择合适的分离条件[18]。研究了CORTECS C18、BEH C18、HSS T3和XBridge BEH C184种色谱柱，以及甲醇-1.0 mmol/L氨水和甲醇-1.0 mmol/L碳酸氢铵水溶液分别作为流动相对4种毒素分离和检测的影响。结果发现，以甲醇-1.0 mmol/L氨水作为流动相，使用CORTECS C18和HSS T3色谱柱，TeA峰形拖尾；使用BEH C18色谱柱，TeA保留能力差，出峰太快，目标化合物的电离易受影响。甲醇-1.0 mmol/L碳酸氢铵做流动相，使用BEH C18色谱柱，4种化合物峰形均出现拖尾的情况；分别使用HSS T3和XBridge BEH C18色谱柱时4种交链孢霉毒素的峰形较好。考虑到HSS T3柱pH值(2～8)耐受范围较窄，而XBridge BEH C18柱pH值(2～12)适用范围广，最终选用XBridge BEH C18做分离柱，甲醇-1.0 mmol/L碳酸氢铵做流动相。

通过流动注射泵直接进样的方式，在ESI-模式下进行一级质谱分析，对去簇电压和锥孔电压进行优化，确定准分子离子峰。接着进行目标离子二级质谱扫描，优化碰撞电压和碰撞室出口电压，得到碎片离子。选择稳定性好、丰度高的两个碎片离子分别作为定性离子和定量离子，并以丰度最强，响应最高的离子作为定量离子，见表1。

2.2 样品前处理方法优化

固相萃取过程中淋洗液及洗脱液的溶剂种类和比例对试验结果影响很大[10-11]，分别优化了3种淋洗方式和两种洗脱方式。淋洗：(1)依次用5 mL 20%甲醇、5 mL含1%甲酸的20%甲醇水溶液和5 mL水淋洗；(2)用5 mL含1%甲酸的20%甲醇水溶液淋洗；(3)用5 mL 20%甲醇水溶液淋洗。洗脱：(1)用5 mL甲醇和5 mL乙腈依次洗脱；(2)用6 mL含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,体积比)混合溶液洗脱。

试验结果见表2。采用淋洗方式3与洗脱方式1组合，发现TeA和TEN的回收率满足要求，AOH和AME回收率较差；采用淋洗方式3与洗脱方式2组合，AOH和AME回收率均达到70%以上。当采用淋洗方式1与洗脱方式2组合时，发现AOH和AME也能满足要求，但是结果稳定性较差。故而确定20%甲醇水溶液为淋洗液，含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,体积比)混合溶液为洗脱液。

表2 不同固相萃取处理方法对4种交链孢霉毒素回收率的影响

进一步研究了洗脱液体积对试验结果的影响。取5 mL空白基质溶液，向其中加入适量标准溶液(TeA、AOH、TEN为100 μg/kg，AME为10 μg/kg)，稀释后上样、净化，用10 mL洗脱液分5次对小柱进行洗脱，每次2 mL，分别收集洗脱液，氮吹，定容到2.0 mL，上机检测。结果显示，第4次和第5次的洗脱液中不含任何待测物，说明6 mL洗脱液可以把样品完全洗脱出来。

2.3 方法评价

对分析方法的特性进行了评估，结果见表3。TeA、AOH、TEN在1.0～100.0 μg/L、AME在0.1～10.0 μg/L范围内具有良好的线性关系(r>0.999)。检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以信噪比为3∶1和10∶1进行计算。

表3 分析方法的特性

为确定方法的准确性，对4种化合物进行了低、中、高三水平加标回收率测定，每个加标水平下平行测定6次，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表4。4种化合物的平均回收率为78.4%～100.3%，RSD≤8.9%，表明该方法对玉米中4种交链孢霉毒素的测定具有较高的回收率和精密度，准确可靠。

表4 玉米样品中4种交链孢霉毒素的回收率和精密度(n=6)

2.4 基质效应

基质效应由基质匹配工作曲线与溶剂标准曲线的斜率之比进行计算[19]。由表3可知，4种毒素都有基质抑制效应，当基质效应导致信号变化大于20%时，基质效应不可忽略，而AOH和AME信号降低50%以上(图1)，为了得到准确的结果，采用基质匹配工作曲线进行校正。

注：A为10%甲醇，B为空白；TeA、AOH、TEN为50 μg/L，AME为5 μg/L；色谱峰1—4分别为TeA、AOH、TEN、AME。

2.5 样品测定结果及污染情况分析

对47份玉米样品进行检测，4种交链孢霉毒素均有检出，测定结果见表5。有66.0%(31/47)的样品至少受一种毒素污染，TeA、AOH、TEN和AME检出率分别为23.4%、10.6%、4.3%和63.8%。TeA检出的含量最高，为32.51 μg/kg。4种毒素平均含量为TeA>AOH>AME>TEN，Zhao等[20]报道小麦粉中4种毒素平均含量为TeA>AOH>TEN>AME，其中TEN的含量为16.0～98.7 μg/kg，而本次研究共采集47份玉米样品，TEN的检出率较低，平均含量为1.04μg/kg，可见该毒素在玉米中的污染情况和小麦有所不同。由表6可知，不同颗粒大小的玉米样品AME毒素检出率分别为玉米面100%、玉米糁88.2%、玉米碴30%、玉米粒20%，可见玉米面、玉米糁与玉米粒、玉米碴相比，毒素检出率较高。此外，受4种毒素污染最为严重的是玉米面，其中TeA检出率为90%，平均值为8.85 μg/kg；AME检出率为100%，平均值为2.65 μg/kg。谷物粉碎后，没有了表皮的保护，在适宜的环境下，霉菌很容易生长繁衍。因此粮食在收割及储藏时尽量保持颗粒完整，且入库前降到安全水分(≤14%)，降低储藏湿度、温度，以降低霉变风险[21]。

表5 玉米样品中4种交链孢霉毒素的检出情况(n=47)

表6 不同种类玉米中4种交链孢霉毒素阳性率

3 结论

建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定玉米中4种交链孢霉毒素的分析方法，4种毒素低中高加标回收率为78.4%～100.3%，相对标准偏差≤8.9%，该方法具有较好的精密度和准确度，满足玉米中4种交链孢霉毒素的检测要求。对采集的47份玉米样品进行检测，结果发现，有66.0%(31/47)的样品至少受一种毒素污染。玉米中4种毒素检出的含量为TeA>AOH>AME>TEN，TeA毒素是玉米中检出的主要毒素，TEN污染程度最低，与小麦粉中4种毒素污染情况有所不同。与玉米粒和玉米碴这种大颗粒样品相比，玉米面污染最为严重，由此推测，样品颗粒度越小，越易受霉菌污染。