池塘与稻田养殖小龙虾感染WSSV的流行病学比较研究

文/徐日俊 顾泽茂 李莉娟 袁军法

为了探究不同养殖模式下小龙虾感染WSSV的现状和养殖环境因素对WSSV发生的影响，作者对湖北省小龙虾养殖主产区进行了WSSV流行病学调查，并定点监测了两个实验基地（潜江市、武汉蔡甸区）的WSSV感染规律。结果显示：湖北省养殖主产区总体带毒率为51.65%，其中池塘为55.29%，稻田为47.60%；正常塘为20.81%，发病塘为72.82%。定点监测结果显示池塘养殖模式的小龙虾带毒率和病毒载量显著高于稻田模式（P＜0.05）。比较发病塘与正常塘的水质环境因子，结果显示正常塘的各水质指标较为稳定，发病塘的各水质指标更为离散。说明不同养殖模式的WSSV流行规律存在显著差异，同水环境质量直接相关，研究结果为WSSV的环境发生机制研究和生态防控策略制定提供了科学依据。

小龙虾，学名为克氏原螯虾（Procambarus clarkii），分类学上隶属甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属。小龙虾为美国中南部和墨西哥北部的土著物种，二十世纪三十年代末由日本传入我国，目前已广泛分布于全国21个省份，并逐渐归化为自然水域的一个物种，成为我国重要的水产经济养殖对象。2018年我国小龙虾养殖总产量达163.87万吨，其中湖北省产量约占全国总产量的一半。随着小龙虾养殖业快速发展，养殖过程中小龙虾疾病的危害日益严重，尤其是白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）给养殖业者带来了巨大的经济损失。

WSSV为双链DNA病毒，属线性病毒科（Nimaviridae）、白斑病毒属（Whispovirus）。该病毒最早在1992年发现于台湾对虾养殖区域，并迅速散播至整个东南亚地区，进而在全球对虾养殖区蔓延，目前WSSV已成为全球甲壳类养殖业的最大威胁。WSSV宿主广泛，对小龙虾易感，患病小龙虾表现为体色发暗、摄食减少、活力下降、反应迟钝，部分静卧于池边水草上，但并不在甲壳上形成白斑。WSSV已被广泛研究，涉及流行病学、致病机理、宿主免疫应答和环境适应机制等方面，但在养殖水环境同WSSV关联机制领域研究较少，尤其是养殖水环境与小龙虾WSSV发生的关系尚未见报道。

目前小龙虾的集约化养殖模式主要有稻田养殖和池塘养殖两种。稻田养殖是一种充分利用水稻插秧、管理与收割的特点，配套进行小龙虾养殖的“双水双绿”养殖模式；池塘养殖是一种传统的高密度养殖模式。两种养殖模式的水环境差别较大，其水质管理措施也截然不同。鉴于尚无对抗WSSV的有效药物，水质调控和生态操控等综合防控措施在WSSV防控中至关重要。为探究不同养殖模式的环境差异对小龙虾感染WSSV的影响，本研究拟通过流行病学调查和定点监测分析不同小龙虾养殖模式中WSSV的流行规律，探究小龙虾白斑综合征发生的主要环境诱因，为小龙虾白斑综合征的预警和生态防控提供科学依据。

一、材料与方法

（一）样品采集

2017年7月～2019年6月期间，从湖北省武汉、汉川、蔡甸、公安、黄冈、孝感、咸宁、潜江、仙桃、洪湖、监利等小龙虾养殖地区，随机选择池塘、稻田养殖模式的正常塘和发病塘，每种模式选择3个以上池塘，每个塘采集10尾以上小龙虾进行检测。取虾鳃保存在2.0mL离心管中，放入液氮罐中带回实验室，-80℃保存备用。选择位于潜江市和武汉市蔡甸区的小龙虾实验基地作为监测点，分别选择池塘养殖、稻田养殖模式各3口塘，每口塘采集10只虾，取鳃用于检测。

（二）水质检测

使用多参数水质分析仪（HQ40D，Hach Loveland，USA）现场测定溶解氧（DO）、电导率（EC）、氧化还原电位（ORP）和pH值，以水产养殖仪（DZB）现场测定氨氮、亚硝态氮和硫化氢。

（三）组织DNA提取

取25mg鳃组织，按照基因组提取试剂盒操作提取组织总DNA，保存于-20℃冰箱备用。

（四）病毒检测

以靶向于WSSV DNA聚合酶的特异性引物WDP06/07，扩增理论目的片段大小330bp，引物序列如下：

PCR反应体系为25μL：10×Easy Taq Buffer2.5μL；dNTPs（2.5 mmol/L）2.0μL；Easy Taq（0.5U/μL）0.1μL；WDP06（10μmol/L）1.0μL；WDP07（10μmol/L）1.0μL；Template DNA1.0μL；灭菌三蒸水17.4μL。Realtime PCR反应体系为：SYBR Premix 10μL、正反向引物各0.5μL（10μmol/L）、模板1.0μL、双蒸水8.0μL，总体积为20.0μL，每个样品重复3次。以SPSS22.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），数据以平均值±标准误（Means±SE）表示。

二、结果

（一）养殖小龙虾携带WSSV的调查

本实验共采集484尾养殖小龙虾，其中发病池塘样品287尾，正常池塘样品197尾。以PCR方法进行检测，结果显示采集的小龙虾带毒率为51.65%。分析不同养殖状态的池塘样本带毒率，结果显示正常池塘带毒率为20.81%，而发病池塘的带毒率为72.82%。不同养殖类型的小龙虾带毒率分析显示池塘养殖模式中小龙虾带毒率为55.29%，稻田养殖模式中小龙虾带毒率为47.60%。详见图1。

（二）养殖小龙虾携带WSSV的定点监测

为了验证不同养殖模式下小龙虾携带WSSV的规律，选择潜江和蔡甸两个小龙虾实验基地，调查4月～6月不同养殖模式下的小龙虾带毒率及病毒载量。结果显示，4月～6月蔡甸基地池塘养殖小龙虾带毒率为57.78%，稻田养殖模式小龙虾带毒率为48.89%；潜江基地池塘养殖小龙虾带毒率68.89%，稻田养殖模式小龙虾带毒率47.78%。详见图2。对两种养殖模式的病毒载量分析发现，池塘养殖模式的小龙虾携带WSSV的载量范围为102copies/µg～1010copies/µg DNA，而稻田养殖模式的载量范围为103copies/µg～108copies/µg DNA之间，其病毒载量中位数低于池塘养殖。

表1 养殖状态对水质指标的影响

（三）WSSV发生的水质环境因子调查

为了调查WSSV发生的环境诱因，选择20个小龙虾发病塘、14个小龙虾正常塘，比较两者的水质指标，包括溶解氧、酸碱度、电导率、氧化还原电位、氨氮、亚硝态氮、硫化氢等共7个指标。结果显示，发病塘中的溶解氧、氧化还原电位、氨氮、亚硝态氮和pH值较正常塘更为离散。其中发病塘的溶解氧和氧化还原电位显著偏低，而氨氮和亚硝态氮显著偏高。两者之间的电导率和硫化氢无显著性差异。详见表1。

（四）不同养殖模式水质指标的比较

为了验证WSSV发生与环境因子的关联，选择潜江和蔡甸两个小龙虾实验基地调查不同养殖模式的水质指标。结果显示，蔡甸实验基地4月～6月池塘和稻田养殖模式中的溶氧等水质指标呈现相似的变化趋势，而池塘养殖模式较稻田养殖的溶氧低，氨氮、亚硝态氮指标偏高。潜江实验基地呈现出相似的变化规律，其酸碱度、电导率和氧化还原电位没有明显变化。详见表2。

三、讨论

小龙虾的主要养殖模式分稻田与池塘养殖两种，其养殖管理、水环境和产量存在明显差异。本研究的结果表明不同养殖模式的WSSV流行规律和水质因子也存在显著差异，为WSSV的环境发生机制研究和生态防控策略制定提供了依据。

流行病学调查显示WSSV是小龙虾养殖的主要威胁，兰江风等研究显示湖北5个养殖区小龙虾的带毒率超过80%，李青彬等发现小龙虾的感染率为52.77%。本研究发现湖北省10个养殖主产区的养殖小龙虾的带毒率为51.65%。因采样范围、季节及WSSV检测方法的不同，不同研究者的流调结果也差异较大，但都表明了养殖的小龙虾携带WSSV较为普遍。其它养殖地区的流行病学调查也呈现类似的结果。此外，采集自正常养殖塘的小龙虾带毒率为14.49%，定点监测也发现未发病的小龙虾携带WSSV的情况，呈“带毒不发病”状态。先前刘波等通过人工感染日本对虾（Penaeus japonicus）复制出“带毒不发病”的类似状态。这些研究提示WSSV或可建立持续性感染。鉴于养殖小龙虾普遍带毒及“带毒不发病”的现状，建立小龙虾白斑病的预警机制，降低发病率和提高养成率将是小龙虾养殖管理的首要问题。

表2 不同养殖模式的水质指标

4月～6月是小龙虾白斑病发生的高峰，流行病学调查显示5月份带毒率高达70%，提示WSSV是引发小龙虾“五月瘟”的主要病原。然后从发病塘的检测数据来看，有近30%的发病虾并未检出WSSV，提示其它病原对小龙虾的危害也不容忽视。New等发现气单胞菌属能够造成小龙虾的大量死亡，付应三等在发病小龙虾体内分离到副溶血弧菌，这些都提示正确诊断、采取合理的应对措施对小龙虾病害的防控十分重要。

针对南美白对虾的研究显示环境胁迫会改变虾的先天免疫，增强WSSV的复制。如氨氮胁迫可以激活南美白对虾的IRE1-XBP1信号通路，激活的XBP1s作为分子伴侣参与WSSV基因wsv023/wsv069，wsv083和wsv059/wsv166的转录调控，增强病毒复制。低氧胁迫降低了南美白对虾的铁蛋白、羧肽酶A2和锌蛋白酶Mpc1的表达，受胁迫的对虾更易受到WSSV的侵袭。亚硝态氮暴露也可减低对虾血pH、氧合血蓝蛋白和血蓝蛋白浓度降低，会产生“低氧胁迫”效应，利于WSSV在虾体内的增殖。而小龙虾与对虾同属于甲壳纲，十足目，生物学和遗传学存在诸多相似地方，本研究显示小龙虾发病塘的溶氧、氨氮和亚硝态氮显著偏低，这些结果说明池塘环境因子变化所致的环境胁迫同小龙虾白斑病的发生直接相关，为通过环境调节和生态操控防控小龙虾WSSV提供了理论依据。

流行病学调查和定点监测都显示稻田养殖模式的小龙虾带毒率要明显低于池塘养殖的小龙虾，与养殖户反馈的稻田养殖的小龙虾发病率要低于池塘的现象一致。水质环境监测显示4月～6月稻田养殖模式较池塘养殖模式的溶氧更高、氨氮和亚硝态氮水平更低，有助于降低养殖小龙虾的环境胁迫。而张启发等提出利用稻田资源，采用绿色新技术和新品种，通过稻田种养，实现水稻、水产协同发展（双水），生产绿色稻米、绿色水产品（双绿）的产业发展模式为新时期的虾稻养殖产业提供了新的蓝本。

溶氧、pH及氨氮等环境因素同WSSV的发生直接相关，为建立基于环境因子的WSSV预警系统提供了理论依据。现阶段，小龙虾消费市场的快速发展吸引了众多的新兴投资者，百亩以上的规模养殖企业成为小龙虾养殖业的主导者，千亩连片的养殖基地也较常见，为小龙虾的智能化养殖管理提供了可能。本研究的结果表明溶解氧、氨氮、亚硝态氮等水环境指标可作为WSSV发生的预警因子。通过在线监测溶氧等相关水质环境因子，结合小龙虾携带WSSV的检测，建立WSSV发生的预警系统，可及早采取干预措施，降低小龙虾的发病率。此外后期还可通过大数据分析和实验室验证来确定诱导WSSV发生的环境因子阈值，通过构建数学模型来建立WSSV暴发预警系统。