传统发酵樱菜中降解亚硝酸盐肠膜明串珠菌的分离鉴定及特性分析

刘笑笑，金永梅，吴 迪，王 莹，魏春雁

（1.吉林省农业科学院，吉林 长春 130033；2.农业部农产品质量安全风险评估实验室（长春），吉林 长春 130033）

泡菜是一类有着悠久历史的传统食品，按产地及口味主要分为中国泡菜、韩国泡菜和日本泡菜，日本泡菜属于非发酵型，中国泡菜和韩国泡菜属于发酵型[1]。朝鲜族泡菜是极具民族特色的中国泡菜之一，种类繁多，各具独特的风味且富含乳酸菌和乳酸[2]。樱菜是朝鲜族人种植的特色蔬菜，营养丰富，味道适合大众口味，但生长期短且具有季节性，因此，将其制成朝鲜族泡菜，提高了其营养价值和贮藏性[3]。

朝鲜族泡菜是一种风味独特的乳酸发酵蔬菜制品，富含活性乳酸菌，可以调节肠道菌群平衡。部分学者已对朝鲜族泡菜中的微生物进行了研究，孟令帅等[4]从25份朝鲜族家庭制作的传统发酵辣白菜中分离出81株乳酸菌，其中34株杆菌、47株球菌，归属于2个属6个种，45株屎肠球菌（Enterococcus faecium）、25 株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、4株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、3株戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、2株短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、2株坚强肠球菌（Enterococcus durans）；刘长蕾等[5]对朝鲜族辣白菜发酵过程中微生物变化进行了研究，结果表明，明串珠菌（Leuconostoc）是发酵蔬菜食品发酵初期的优势菌，发酵至8 d时明串珠菌数量达到最高，发酵20 d后，检测不到明串珠菌。目前对朝鲜族泡菜的研究集中于朝鲜族辣白菜，对传统发酵樱菜的研究报道甚少。此外，朝鲜族泡菜制作简便、成本低廉、食用方便，但发酵过程中存在着食用安全的问题，最值得关注的就是亚硝酸盐，因此，分离降解亚硝酸盐的菌株很有必要。

肠膜明串珠菌是乳酸菌中明串珠菌属（Leuconostocsp.）的重要菌种[6-8]，是自然发酵食品中的优势细菌[9]。对人和动物均无毒性和致病作用，尤其是肠膜明串珠菌肠膜亚种已被我国卫生部（2012年第8号公告）与美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）列为可食用菌种之一[10]。肠膜明串珠菌具有促进营养物质吸收，改善产品风味，同时具有抗氧化能力和拮抗致病菌能力[11-12]。因其能够产生特殊风味物质，在乳和泡菜等食品领域广泛应用[3，13-14]。

本研究从具有民族特色的延边朝鲜族地区采集24份传统发酵樱菜，从中分离筛选具有降解亚硝酸盐功能的肠膜明串珠菌，通过形态观察、生理生化试验和16S rDNA基因序列分析进行鉴定，并对其生长特性、产酸特性、耐盐特性和耐酸碱特性进行研究。旨在为进一步研究其生理功能和开发应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

24份传统发酵樱菜分别取自延边朝鲜族自治州金刚山泡菜专卖店、农贸市场和超市，取样时间为2017年4月9日。

1.1.2 主要试剂

亚硝酸钠（分析纯）：昆山东南化工材料有限公司；氯化钠（分析纯）：东莞市聚鹏化学有限公司；1%万古霉素（分析纯）：青岛高科园海博生物技术有限公司；扁桃苷、熊果糖、水杨苷、赤藓醇（均为优级纯）：上海麦克林生化科技有限公司；甘露糖（优级纯）：德国MERCK公司；L-鼠李糖（分析纯）：上海化学试剂总厂试剂二厂；半乳糖、山梨醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-木糖、棉子糖、L-山梨糖、蜜二糖（均为优级纯）：美国Sigma公司；Ezup柱式细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培养基

最低必需培养基（lowest minimal medium，LMM）、MRS固体培养基、MRS液体培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

PRESOCLAVE-Ⅱ高压灭菌器：西班牙SELECTA公司；2720 thermal cycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Applied Biosystems公司；HC-2518R冷冻高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；CX41-RF荧光显微镜：日本OLYMPUS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 肠膜明串珠菌的分离与纯化

无菌条件下，取延边朝鲜族传统发酵樱菜汁1 mL涂布于LMM固体培养基，28 ℃倒置恒温有氧培养48～72 h。挑取周围产生水滴状粘稠性多糖的菌落，在含有30 μg/mL万古霉素的MRS固体培养基上划线分离纯化2～3次。挑取单菌落，经镜检，确认获得单一菌种。

1.3.2 降解亚硝酸盐菌株的筛选

以不加亚硝酸钠的MRS液体培养基为空白对照，取分离的菌株，以3%（V/V）的接种量分别接种于含质量浓度为150 μg/mL亚硝酸钠的MRS液体培养基中，30 ℃、140 r/min条件下恒温振荡培养24 h，采用盐酸萘乙二胺法[15]测定菌液中亚硝酸盐含量，并计算亚硝酸盐降解率，其计算公式如下：

式中：X为亚硝酸盐降解率，%；Y为亚硝酸钠初始含量，mg/kg；Y1为发酵后亚硝酸钠含量，mg/kg。

选筛亚硝酸盐降解率＞50%以上的菌株。

1.3.3 降解亚硝酸盐菌株的鉴定

（1）形态观察及生理生化试验[16-18]

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[17]和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[18]的方法对筛选菌株进行形态观察及生理生化鉴定。生理生化试验项目包括37 ℃生长试验、1 ℃生长试验、过氧化氢酶试验、耐盐性试验、精氨酸水解试验、葡聚糖生成试验、柠檬酸利用试验、七叶苷水解试验和碳水化合物发酵试验。

（2）分子生物学鉴定

采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA，以其为模板，选用16S rRNA通用引物进行PCR扩增[19-20]，正向引物为7F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；反向引物为1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR扩增体系：基因组DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL、10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL、TakaraTaq酶0.2 μL、引物7F0.5μL、引物1540R0.5μL、加双蒸水（ddH2O）至25μL。

PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃再延伸10 min。

PCR扩增结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，选取碱基长度为1 500 bp处亮度和长度适宜的条带，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行基本局部比对工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）检索，选取序列同源性最高的已知菌种的16S rRNA序列，采用MEGA软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树[21]。

1.3.4 降解亚硝酸盐菌株生长特性研究

最适生长温度的测定：取活化的筛选菌株，以2%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基中，分别置于25 ℃、28 ℃、30 ℃和36 ℃培养48 h，采用分光光度计在波长600 nm处测定其吸光度值（OD600nm值）。

生长曲线的测定：以不接菌的MRS液体培养基为空白对照。将活化好的筛选菌株以2%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基中，30 ℃、140 r/min条件下恒温振荡培养，每隔2 h取样，采用分光光度计测定其在波长600 nm处的吸光度值（OD600nm值）。

产酸能力的测定：以不接菌的MRS液体培养基为空白对照。将活化好的筛选菌株，以2%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基中，30 ℃、140 r/min条件下恒温振荡培养，每隔2 h取样，测定其pH值。

耐盐性能的测定：取活化的筛选菌株，以2%（V/V）的接种量分别接种于含0、4%、6%、8%和10% NaCl的MRS液体培养基中，30 ℃、140 r/min条件下恒温振荡培养24 h，采用分光光度计测定其在波长600 nm处的吸光度值（OD600nm值）。

耐酸碱性能的测定：以不接菌的MRS液体培养基为空白对照，将活化好的筛选菌株以2%（V/V）的接种量分别接种于初始pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的MRS液体培养基中，30 ℃、140 r/min条件下恒温振荡培养24 h，采用分光光度计测定其在波长600 nm处的吸光度值（OD600nm值）。

1.3.5 数据处理与分析

采用SPSS Statistics 17.0和Excel 2007软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 肠膜明串珠菌的分离与纯化

通过LMM培养基分离，从24份传统发酵樱菜中共分离出20株带有水滴状粘稠性多糖的菌落；其中17株能在含30 μg/mL万古霉素的MRS固体培养基上生长。

2.2 降解亚硝酸盐菌株的筛选

测定分离得到的17株菌株的亚硝酸盐降解能力，亚硝酸盐降解率见图1。

图1 17株菌株的亚硝酸盐降解能力Fig.1 Nitrite degradation capacity of 17 strains

由图1可知，菌株JNZB003、JNZB005、JNZB009 和JNZB015的亚硝酸盐降解率均＞50%，分别为95.92%、88.36%、52.71%、61.62%。

2.3 降解亚硝酸盐菌株的鉴定

2.3.1 形态学特征

4株具有降解亚硝酸功能的菌株中，菌株JNZB003在LMM培养基和含30 μg/mL万古霉素的MRS培养基上的菌落形态见图2，4株菌株革兰氏染色镜检结果图3。

图2 菌株JNZB003在LMM培养基（a）和含30 μg/mL万古霉素MRS固体培养基（b）上的菌落形态Fig.2 Colony morphology of strain JNZB003 on LMM medium (a) and MRS solid medium with vancomycin 30 μg/ml (b)

图3 筛选菌株的革兰氏染色结果Fig.3 Gram staining results of screened strains

由图2可知，菌株JNZB003在LMM培养基上呈水滴状菌落，在30 μg/mL万古霉素MRS培养基上，菌落呈圆形、乳白色、表面光滑，其他菌株菌落形态相似。由图3可知，4株菌株均为革兰氏阳性菌，细胞形态呈球形和短杆形，成对或成短链排列。

2.3.2 生理生化试验

将4株具有降解亚硝酸盐功能的菌株进行生理生化试验，结果见表1～表2。

表1 筛选菌株生理特性鉴定结果Table 1 Identification results of physiological characteristics of screened strains

由表1可知，4株菌株均对30 μg/mL万古霉素具有耐受性，过氧化氢酶阴性，1 ℃条件下均不生长，37 ℃条件下均生长；在3%和6.5%氯化钠溶液中不同程度生长，其中菌株JNZB003、JNZB009和JNZB015在3%和6.5%氯化钠溶液中生长良好，菌株JNZB005在3%氯化钠生长良好，但在6.5%氯化钠溶液中微弱生长。

表2 筛选菌株生化特性鉴定结果Table 2 Identification results of biochemical characteristics of screened strains

由表2可知，4株菌株精氨酸水解试验均为阳性反应；菌株JNZB003和JNZB009能够代谢柠檬酸，而菌株JNZB005和JNZB015不能代谢柠檬酸；菌株JNZB003和JNZB015能水解七叶苷，而菌株JNZB005和JNZB009不能水解七叶苷；菌株JNZB003、JNZB005和JNZB009能生成葡聚糖，而菌株JNZB015不能生成葡聚糖。

表3 筛选菌株的碳源利用试验结果Table 3 Results of carbon source utilizing tests of screened strains

由表3可知，4株菌株都可以利用纤维二糖、蜜二糖、蔗糖、果糖、熊果糖、海藻糖、甘露糖、水杨苷、扁桃苷；都不能利用赤藓醇、山梨醇、L-山梨糖和L-鼠李糖；此外，菌株JNZB003可以利用半乳糖、麦芽糖、D-木糖、棉子糖、L-阿拉伯糖和核糖；菌株JNZB005可以利用D-木糖和L-阿拉伯糖；菌株JNZB009可以利用半乳糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖和D-木糖。

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中对明串珠菌属的描述，结合形态学特征、生理生化特性试验，初步判断4株菌株均为明串珠菌属（Leuconostocsp.）。

2.3.3 菌株的16S rRNA基因序列分析

在形态学特征和生理生化试验基础上，对筛选的4株菌株进行16S rRNA序列分析，构建系统发育树。以提取的4株菌株基因组为模板，利用16S rRNA通用引物，分别扩增出1.5 kb的目的片段。通过PCR产物纯化、克隆、测序，获得4株菌株的近乎全长16S rRNA 基因片段。通过NCBI数据库BLAST检索，选取序列同源性最高的已知菌种的16S rRNA序列，采用MEGA软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树，结果见图4。

图4 基于16S rRNA基因序列4株菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 4 strains based on 16S rDNA gene sequences

由图4可知，4株菌株均属于明串珠菌属（Leuconostocsp.）。其中菌株JNZB003与肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）亲缘关系最近；菌株JNZB005和JNZB009与冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）亲缘关系最近；菌株JNZB015与肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）亲缘关系最近。

综上，综合形态学特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，将菌株JNZB003鉴定为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株JNZB005、JNZB009鉴定为冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum），菌株JNZB015鉴定为肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）。

2.4 肠膜明串珠菌JNZB003的生长特性分析

同种微生物因来源不同，在某些特性上存在一定的差异。因此，对既具有民族地方特色又是新菌源分离的肠膜明串珠菌JNZB003的生长特性进行分析，结果见图5。

图5 肠膜明串珠菌JNZB003的生长特性Fig.5 Growth characteristic of Leuconostoc mesenteroides JNZB003

由图5A可知，肠膜明串珠菌JNZB003的生长温度范围较宽，在25～30 ℃范围内均能良好生长，最适生长温度为30 ℃。

由图5B可知，随着NaCl含量的增加，肠膜明串珠菌JNZB003生长能力逐渐减弱，当NaCl含量为8%时，菌株生长缓慢，当NaCl含量达到10%时，菌株微弱生长。朝鲜族泡菜含盐量一般在8%～10%，表明此菌在这个环境条件下有活性。

由图5C可知，肠膜明串珠菌JNZB003具有良好的生长特性，培养0～6 h，为迟滞期；培养6～14 h，为对数期；培养14 h后进入稳定期，此时OD600nm值达到1.52；培养48 h时，OD600nm值最高，达1.91，之后OD600nm值开始缓慢降低，进入衰减期。

由图5D可知，肠膜明串珠菌JNZB003产酸较快，培养12 h时，pH值降至4.60；培养24 h时，pH值降至4.16；培养28 h时，pH值降至3.98；培养28 h后，pH趋于稳定。产酸快，影响发酵程度及产品的风味和品质，且能抑制杂菌生长。

由图5E可知，肠膜明串珠菌JNZB003的最适生长pH值为6.0。当pH值＜4.0和pH值＞10.0时，菌株生长缓慢；当pH值为2.0和11.0时，菌株也能微弱生长，说明此菌耐酸碱性能较好。

3 结论

本研究从具有民族特色的延边朝鲜族地区采集24份传统发酵樱菜，从中分离筛选出4株具有降解亚硝酸盐功能的疑似肠膜明串珠菌。通过形态学特征、生理生化试验和16S rRNA序列分析鉴定菌株JNZB003为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株JNZB005、JNZB009为冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum），菌株JNZB015为肉明串珠菌（Leuconostoc carnosum）。肠膜明串珠菌JNZB003在含150 μg/mL亚硝酸盐的MRS液体培养基中培养24 h时，亚硝酸盐降解率高达95.92%，其最适生长温度为30 ℃，最适生长pH值为6.0，培养14 h生长进入稳定期，培养12 h pH值降至4.60，当NaCl含量为8%和pH值为3～10时，能够生长，具有良好的降解亚硝酸盐能力、生长特性、产酸能力，且耐盐和耐酸碱。