验证钠离子的主动运输需要能量

迟向向 刘斯璐

（北京师范大学第二附属中学未来科技城学校 北京 102209）

《普通高中生物学课程标准（2017 版）》在说明模块1《分子与细胞》的教学时，提出让学生了解细胞生命活动中物质、能量和信息变化的统一，并且特别提出了“物质通过被动运输、主动运输等方式进出细胞，以维持细胞的正常代谢活动”的重要概念，在本模块的教学提示中强调了“教师要组织好各种观察、实验等探究性学习活动，从而帮助学生增加感性认识，克服对微观结构认识的困难，使学生领悟科学研究的方法并习得相关的操作技能”。在教学中应让学生积极参与动手和动脑的活动，通过探究性学习活动或完成工程学任务，从而加深对生物学概念的理解，提升应用知识的能力，培养创新精神，进而能用科学的观点、知识、思路和方法，探讨或解决现实生活中的某些问题［1］。

人教版高中生物学必修1《分子与细胞》中第4章第3 节“物质跨膜运输的方式”中重点介绍了2种运输方式：被动运输和主动运输。其中对于被动运输，教材中以植物细胞的吸水和失水（即质壁分离实验）简单帮助学生增加直观认知。而对于主动运输，作为一种重要的运输方式，它保证了细胞可按照生命所需主动吸收营养物质，排出代谢废物，充分体现了生命活动的主动性。但教材却缺乏相关实例，仅以动画模型的方式作简单介绍。教师在教学中常使用动画模拟的形式，这种方式的教学效果方面远不及动手实验。学生在对主动运输的2 个重要特点（即需要载体和能量）的理解上存在很大障碍。本实验以此为基础，选用细胞呼吸抑制剂抑制细胞内能量的供应，验证主动运输需要能量，同时还对不同的细胞呼吸抑制剂进行了比较和筛选，综合考虑多种因素，最终确定丙二酸钠是最适合在高中生物学实验中推广的细胞呼吸抑制剂。

1 实验原理

1.1 实验试剂选择

1.1.1 目标离子的选择 钠离子是植物所需的矿物质元素之一。高等植物在吸收钠离子时，需要具有以H+为工作离子的质膜ATP 酶。它水解ATP 的部分在质膜的细胞质一侧，ATP 水解产生的能量将细胞质中的H+泵至膜外，使膜内H+浓度降低而膜外H+浓度升高，同时产生膜电位的过极化。使质膜两侧产生了质子浓度梯度和膜电位梯度，这二者之和称为电化学势梯度，又称为质子动力，驱动钠离子进入到细胞中，这种运输方式称为次级主动运输，此过程需要消耗能量［2］。能量由细胞中的直接能源物质ATP 水解提供，而细胞呼吸又是ATP 的重要来源之一，如果抑制细胞呼吸，以主动运输方式进入细胞的钠离子的运输速率就会受到阻碍。而钠盐的种类丰富多样，为了最大程度地保证实验结果不受其他因素干扰，实验选用了植物MS 培养基重要组成成分之一的钼酸盐。钼酸盐是一种强碱弱酸盐，而对于溶液pH 值的作用，钠离子的影响更大，其次钼酸钠溶于水无色透明，不影响实验观察，并且毒性及环境污染性极低、易获取，更适合于中学实验。

1.1.2 细胞呼吸抑制剂的选择

1）叠氮钠。细胞呼吸过程是依靠于分子氧在内的电子传递系统或电子传递链完成。电子传递链位于线粒体内膜，是由递电子体和递氢体组成的，传递体由4 个复合体组成，电子通过这些复合体传递到分子氧，此过程可被某些特异性的抑制剂所抑制［3］。叠氮钠就是一种能抑制电子从复合体Ⅳ转移到氧气的转移性抑制剂［4］。

2）丙二酸和丙二酸钠。在呼吸作用的三羧酸循环中，琥珀酸在琥珀酸脱氢酶的催化下被氧化生成延胡索酸，琥珀酸脱氢酶含有铁硫中心和共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），来自琥珀酸的电子通过FAD 和铁硫中心，然后进入电子传递链［5］。丙二酸的结构和琥珀酸类似，可与琥珀酸竞争性地结合酶的活性中心，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，所以可阻断三羧酸循环［6］。丙二酸钠是线粒体呼吸链氧化磷酸化酶系复合体Ⅱ中琥珀酸脱氢酶的可逆性抑制剂。

1.2 实验材料选择 如何检测钠离子的运输过程？学生在初中阶段就已知钠离子是一种强碱盐，能改变细胞内的pH 值，而在植物细胞内恰好存在一种天然的酸碱指示剂——花青素，能随着细胞内pH 值的变化发生明显的颜色变化［7］，在碱性环境中会变成蓝色甚至深蓝色，而在酸性环境中则变成红色。在“植物细胞的质壁分离实验”实验中，学生恰巧接触过这样一种富含花青素的材料——紫色洋葱，其外表皮细胞有紫色大液泡，操作简单、效果较好。

2 实验方法

1）制片：撕取紫色洋葱外表皮分别置于蒸馏水、0.1 mol／L NaN3、0.1 mol／L 丙二酸、0.1 mol/L丙二酸钠中浸泡2 min 后制作临时装片。

2）观察：显微镜观察细胞颜色及形态。

3）实验：从盖玻片的一端滴加2 mol／L 钼酸钠溶液，另一端用吸水纸吸引，观察并记录实验现象。

3 实验结果

3.1 钠离子的跨膜运输会使细胞内pH 值发生改变，引起花青素颜色变化 从图1（本文附图见封四）可观察到，随着钠离子的跨膜运输，细胞内花青素的颜色由浅紫色逐渐变为蓝色，最后变为深蓝色。此过程颜色变化非常迅速，少数细胞在2 min后即变为深蓝色，其他部分细胞基本在5.5 min左右全部变色。

3.2 呼吸酶抑制剂叠氮钠能抑制钠离子的跨膜运输 通过实验1 的结果，可发现钠离子的跨膜运输的确会引起细胞内的颜色变化，且此过程的速度较快。钠离子是以主动运输的形式跨膜运输，此过程最主要的特点是需要ATP 水解提供能量，而细胞内ATP 的主要来源之一是细胞呼吸。加入细胞呼吸抑制剂后，钠离子的转运速度是否会受影响？

图2 中，与对照组相比，经叠氮钠处理后细胞内花青素的颜色变化非常缓慢，在处理5.5 min后视野中仅有少数细胞刚开始发生颜色变化；在处理长达25 min 后，细胞才开始出现较为明显的蓝色。这说明抑制细胞呼吸阻断细胞内能量供应的确能抑制钠离子的主动运输，进一步验证了主动运输过程是需要能量的。

3.3 不同呼吸抑制剂对钠离子的跨膜运输的作用 呼吸抑制剂多种多样，它们具体效果如何，哪一种又比较适合在高中生物学实验推广？基于上述考虑，选用了叠氮钠、丙二酸、丙二酸钠3 种细胞呼吸抑制剂进行比对，结果如图3。

根据图3 可知，加入不同类型的呼吸抑制剂后，细胞内颜色变化的速率明显下降，视野中发生变化的细胞数目也少了许多，这再次验证了之前的结论：不同的抑制剂均可通过抑制细胞内能量供应来抑制钠离子的主动运输。通过对比还发现，在这3 种呼吸抑制剂中，在丙二酸钠组处理25 min 后，不仅视野中发生颜色变化的细胞数目最少，而且颜色变化的速率最慢，颜色也最浅，说明其抑制效果最为显著。

综上所述，丙二酸钠的抑制效果最为明显，而且相比于其他呼吸抑制剂毒性较低、更易获取，所以最适合在高中生物学实验中进行推广。

4 讨论与展望

本实验从学生实际出发，以生物学科核心素养为基本理念进行设计，操作简单、耗时较短，可在40 min 内完成且成本较低，很好地帮助学生攻克主动运输需要能量这一难点，提高了高中生物学的教学效果。

本实验也存在一定的局限性，例如选用的呼吸抑制剂种类较少，后续可选用其他类型的呼吸抑制剂例如呼吸链解偶联剂2，4-二硝基苯酚（DNP）及质膜H+-ATPase 抑制剂钒酸钠（Na3VO4）等继续展开实验。主动运输的另外一个重要特点是需要载体蛋白的协助，故可使用特异性的载体抑制剂证明主动运输过程需要载体的协助，进而和协助扩散进行对比，验证协助扩散是只需要载体蛋白不需要能量，帮助学生彻底攻克物质跨膜运输这一难点。