镁及常用镁合金的溶血实验和改良实验及对现行评价标准的探讨

李政垚 刘洁颖 赵宇 高鹏 王以朋

（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科，北京 100730）

在医疗器械/材料的评价中，对医疗器械材料生物相容性的评价是首要的,溶血实验用来测定医用材料对红细胞的影响有重要价值，直接或间接造成明显溶血反应的材料应用会受到限制。

目前骨科最常用的内置物是螺钉、接骨板等，其主要目的是稳定骨的断端，为骨的愈合创造条件。金属材料因其有良好的生物相容性、可靠的机械强度、优异的断裂韧性成为医用骨科材料的首选，目前常用材料包括不锈钢、钛和钴铬钼合金。但这些材料存在以下问题：①长期滞留造成永久性物理刺激、慢性炎症反应[1]；②缓慢释放有毒元素[1,2]；③过强的机械性能，与骨骼之间的弹性模量差异造成的“应力遮挡”效应可干扰骨的新陈代谢，从而造成骨丢失，甚至出现继发性骨折[3]；④需二次手术取出，造成患者痛苦及医疗资源占用。因此可降解植入材料的研发已经成为热点领域之一。

目前常作为骨科医用的可降解金属材料包括镁合金、铁合金及锌合金等。镁，由于有良好的生物相容性及可降解性，逐渐成为可降解骨科材料研究的热点[4,5]。镁在体内主要降解过程如下。

首先水溶液中镁的腐蚀是一种电化学现象[6]：

Mg+2H2O →Mg(OH)2+H2

接下来如果腐蚀性介质中含有浓度高于30 mmol/L的氯化物，则发生如下反应[7]:

Mg(OH)2+2Cl-→MgCl2+2(OH)-

实际上其在体内降解过程更加复杂，体液中存在钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子、蛋白质、细胞、微生物等都共同参与其降解的过程[8,9]。

我国的现行国家标准GB/T 16886[10]列出了溶血实验总则，但并未给出实验过程及选择实验方法的原则。在具体实施该实验时，研究机构都会选用GB/T 16175-2008《医用有机硅材料生物学评价实验方法》[11]中的溶血实验方法。但有报道发现按照如上方法进行直接接触法溶血实验时，多种镁合金体现出较强的导致溶血的作用[12-18]。为进一步探求镁及镁合金的生物相容性，本研究对纯镁及3种镁合金进行溶血实验（直接接触法）和改良实验进行评价，并根据结果对现行医用材料溶血评价标准进行探讨。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

生理盐水（normal saline,NS）（安徽，双鹤），DPBS缓冲液（北京，四环阳生），超纯水机（美国，Aquapro 公司），酶联免疫检测仪（美国，Thermo 公司），ICP-AES 分析仪（日本，岛津公司），pH 计（意大利，HANNA公司）。

1.2 样品的制备

按照GB/T 16886原则，采用GB/T 16175-2008的实验方法，按照材料重量/溶液容积5 g/10 ml的比例，将纯镁Mg9999（99.99%Mg，河南宇航金属材料有限公司）、镁合金BM ZG 20（Mg-2.5%Zn-0.05%Ca，西安卓恰医疗器械有限公司），镁合金AZ31B（Mg-2.5-3.5%Al-0.6-1.4%Zn-0.2-1%Mn，营口银河金属材料有限公司），镁合金WE43（Mg-3.85%Y-0.48%Zr-2.14%Nd，贵州安吉有色铸造有限公司）在相应容积的NS中制备，于恒温水浴中37℃±1℃保温30 min，平行制备3管。以相同重量/溶液容积比例将上述材料使用D-PBS缓冲液同法制备样品。同法恒温水浴分别制备3 管同体积NS、D-PBS 缓冲液作为阴性对照组，3管注射用水作为阳性对照组。

分别抽取3只新西兰大白兔外周血混合，收集于含草酸盐的抗凝试管中，取8 ml兔血与10 ml NS充分稀释。

1.3 溶血实验（直接接触法）

全部试管放入恒温水浴37℃±1℃保温30 min后，按照0.2 ml稀释兔血/10 ml实验液的比例，每只试管加入稀释兔血，轻轻混匀，置37℃±1℃水浴中继续孵育60 min，倒出管内液体，500 g离心5 min。吸取100 μl上清液移入96 孔细胞培养板内，于540 nm 波长处测定吸光度（optical density,OD）值。

1.4 溶血率计算

使用以下公式计算溶血率：溶血率（hemolysis rate,HR）=[(实验组OD 值-阴性对照组OD 值)/(阳性对照组OD值-阴性对照组OD值)]×100%

按照本实验检验医疗器械时，合格的判定指标一般规定为溶血率＜5%。

1.5 上清液镁离子浓度分析及pH值测定

使用pH 计测定各试管内液体pH 值。收集剩余各试管内上清液，4℃冷藏保存，24 h 内送检，使用电感耦合等离子体原子发射光谱（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy,ICP-AES）仪分析上清液镁离子浓度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。所获数据均以均数±标准差表示。溶血实验同一材料组内比较以及各组间比较采用独立样本t检验，使用Bonferroni校正法校正。数据间的相关性以Spearman相关系数进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组溶血率

各组溶血实验结果如图1 所示，4 种材料使用2种测试介质共8组，实验组上清液在540 nm处OD值均高于阴性对照组，提示各实验组均发生溶血现象。

如图2所示，在同一材料组中，NS作为实验介质时OD值显著高于D-PBS缓冲液组。

各组溶血率如表1所示，所测定的4种镁基金属材料中，使用NS作为测定介质时，各组都体现出了较高的溶血率，溶血率最低的BM ZG 20 镁合金组也达到34.0%±2.7%，最高的AZ31B 组可达到75.5%±4.4%。而当使用D-PBS 缓冲液作为测定介质时，各组溶血率出现显著下降，仅BM ZG 20 组最高达到5.3%±3.5%，其余组均低于5%。同一材料使用不同介质时出现的差异均有统计学意义。

2.2 各组镁离子浓度

各组实验后上清液镁离子浓度如表2所示，由于NS 及D-PBS 2 种介质均不含镁离子，上清液中镁离子总量应为材料在溶液中降解产生的镁离子与红细胞破裂后少量镁离子之和。镁离子含量最高的为AZ31B-NS 组，浓度为（40.17±0.49）mg/L，其他以NS为实验介质的组则镁离子含量比较接近，约20 mg/L左右。而以D-PBS 为介质的组中，镁离子含量最高的是AZ31B-DPBS组，浓度为(20.98±0.49)mg/L，最低为BM ZG 20-DPBS 组，浓度为(14.69±0.37)mg/L。同种材料来看，D-PBS 缓冲液作为测试介质上清液镁离子含量均低于NS组，且差异均有统计学意义。

2.3 各组上清液pH值

如表2所示，4种金属材料采用NS作为测试介质时，溶液pH 值上升更明显，均在10～11 之间，其中pH 值上升最明显为AZ31B-NS 组为10.7±0.1，pH 值上升最少的BM ZG 20-NS组也达到10.1±0.2。以DPBS 缓冲液为测试介质时，pH 值上升最明显为AZ31B-DPBS 组，也仅为9.1±0.3。同种材料组内来看，D-PBS 缓冲液作为测试介质上清液pH 值均低于NS组，且差异均具有统计学意义。

2.4 溶血率与镁离子浓度、pH值相关性分析

图1 不同介质组溶血实验后上清液在540 nm处OD值

图2 不同材料组溶血实验后上清液在540 nm处OD值

以2种不同测试介质对实验组分组，各组溶血率与镁离子浓度及pH 值相关性分析如表3 所示。以NS 为测试介质时，溶血率与样品上清液pH 值、镁离子浓度均体现出了显著正相关性，而D-PBS 缓冲液作为测试介质时，溶血率则不与上述因素相关。

3 讨论

参考我国公认的评价标准，本研究采用的实验方法主要参考GB/T 16175-2008《医用有机硅材料生物学评价实验方法》中的溶血实验（直接接触法）方法，这也是目前在骨科医疗器械评价中的最常用到的实验方法，传统金属材料常规也按照此法进行评价。在此实验方法的基础上，为适当减少实验过程中pH值急骤上升的现象，我们拟将评价介质由NS更换为一种缓冲液进行平行实验作为另一研究组。现行3种主要国际标准中，D-PBS缓冲液被美国材料与试验协会（American Society for Testing and Materials,ASTM）[19]选用，与D-PBS 缓冲液相比，PBS 缓冲液中含有镁离子和钙离子，可能镁离子会造成对溶血实验过程中产生的镁离子量评价不准确，同时有钙离子存在时，可能会和磷酸根一起参与和氢氧化镁的反应在材料表面生成磷酸-镁-钙盐保护层，造成对实验的干扰。HANKS 液和模拟体液(simulated body fluid,SBF)中同样含钙、镁离子，同时成分更加复杂，其中含有硫酸根、葡萄糖等，SBF中还含有碳酸根，可能和实验中的镁离子等发生反应形成沉淀造成干扰。而MEM 培养基同样含有钙、镁离子、碳酸氢根、碳酸根、硫酸根等可能影响实验结果的物质，同时还包含很多营养物质如氨基酸、葡萄糖等，对于可降解材料的评价来说干扰因素过多，不适合作为一种“评价标准”使用的测试介质。所以综上来看，本研究选取了D-PBS缓冲液作为测试介质。

本实验结果提示，镁及镁合金在NS 作为测试介质时对兔血起到了很强的溶血效应，溶血率34.0%～75.5%不等，如果按照此测试方法的结果，镁及镁合金材料作为一种体内置入的医疗器械显然是不妥的。但是，当我们将测试介质更换为D-PBS 缓冲液时，各实验材料的溶血效应大幅度降低，仅有BM ZG 20组溶血率略微超过5%，其他组均在5%以下，符合医疗器械生物相容性的标准。

表1 各实验组溶血率（±s，%）

表1 各实验组溶血率（±s，%）

注：与同材料NS组比较，△P＜0.0025

表2 各实验组镁离子浓度测定及pH值（±s）

表2 各实验组镁离子浓度测定及pH值（±s）

注：与同材料NS组相比，△P＜0.0025

当使用2种不同的测试介质时，测试的结果产生了巨大的差异，那么造成这种差异的原因是什么？从本实验结果看，镁及镁合金作为一种可降解材料，在2种溶液中均发生了降解，主要降解产物即镁离子和OH-，造成了溶液pH值的升高。而所有材料在NS中的降解造成的镁离子和pH 值升高都较D-PBS 缓冲液中更显著，其中以pH值升高更为明显，这可能是D-PBS 缓冲液对酸碱度的缓冲效果造成的。而镁离子浓度方面，D-PBS 组镁离子浓度更低可能存在以下2 个原因：D-PBS 缓冲液中含有少量磷酸根（8.1 mmol/L）和磷酸二氢根（1.1 mmol/L），其可能和溶液中降解生成的游离镁离子结合形成磷酸-镁盐沉淀降低镁离子浓度；同时磷酸根可能直接和镁/镁合金表面与H2O 反应生成的氢氧化镁直接反应形成表面沉积的磷酸-镁盐保护层，这则有可能影响到溶血实验的结果。但是由于D-PBS缓冲液中的氯离子浓度（137 mmol/L）远高于磷酸根和磷酸二氢根的浓度，其和材料表面的氢氧化镁反应更活跃，所以形成材料表面磷酸-镁盐保护层的量较小，对实验结果的影响有限。结合本研究中的相关性分析来看，在NS组，材料溶血率显著与pH 值和镁离子浓度正相关，且相关性很强，溶血可能是和以上2个因素相关。通过进一步计算，所有测试组的镁离子浓度测定结果在0.61～1.67 mmol/L之间，与哺乳动物血清中0.8～1.2 mmol/L正常值接近，且在D-PBS缓冲液组中，高镁离子环境下也未出现明确溶血。Zhen 等[20]的研究采用了和本研究相同的样本处理和实验方法，对纯镁进行溶血性的研究，分别采用NS和PBS缓冲液作为测试介质，发现在PBS缓冲液组，溶血率显著下降，溶液中镁离子浓度上升和pH值上升都较NS组更缓和，这与我们的研究结果相符合。同时该研究配置了不同浓度高镁离子和不同pH值的NS溶液进行溶血实验，发现高镁离子不会造成溶血率大幅上升，但是当pH值高于10时，溶血率会出现大幅上升。该研究同时使用不同浓度高镁离子培养基和不同pH值的碱性培养基对L929细胞系进行培养，发现在pH值高于11时细胞生存率陡然下降。该研究认为，纯镁降解过程中造成的实验溶液pH上升可能是造成溶血率上升的主要原因。综上分析，考虑使用NS作为测试介质时，pH值的大幅升高与溶血效应的正相关性更值得关注。

表3 Spearman分析各实验组溶血率与镁离子浓度及PH值相关性(r值)

直接接触法溶血实验的目的，主要是验证当红细胞直接接触材料时是否会发生溶血反应造成严重的副作用。但依据上述实验方法对镁及镁合金进行检验时，却因为溶液pH显著增高造成了溶血反应，而利用缓冲液测试时，红细胞的直接接触反而没有出现明显的溶血反应。但显然在人体内，体液不断流动、交换，同时体液内存在缓冲系统，并且镁及镁合金材料表面在体内会形成更复杂的化合物保护层，以上这种内植物区域局部pH值增加的效应在体内相对在NS溶液中会更加缓和，这种使用NS作为测试介质的实验方式会误导我们对这种可降解医用材料生物相容性的判断，另一对镁合金溶血实验进行研究的学者也持有相同看法[12]。所以最近已经有学者[21]开始使用缓冲液作为可降解材料溶血实验的测试介质，发现这种情况下镁合金溶血率很低，但是这种方式暂时还不具备检验标准的法律支持。在材料的研发中，很多研究[22,23]通过各种方式如表面覆膜来降低材料的降解速度，进而在此评价标准下改善溶血实验的结果。这不仅将材料复杂化，而真正应用时覆膜降解后红细胞直接接触的仍是镁合金表面，这无疑与我们评价标准的设立目的是相悖的。并且在现有标准的指导下，一些研究[17,24-26]会得出单纯镁合金在生物相容性方面明显较经表面处理过的镁合金差的结论，这种结论可能与事实不完全相符，这显然有可能增加对医用材料研发的成本。

我国目前用于验证材料生物相容性的现行国家标准GB/T 16886.4[10]主要参考的即为国际性标准ISO 10993.4[27]，但是ISO 10993.4 标准列出了溶血实验总则，但并未给出实验过程及选择实验方法的原则。在具体实施时，传统的溶血实验方法为按照GB/T 16175-2008《医用有机硅材料生物学评价实验方法》进行，即本实验采用的溶血实验评价方法。目前世界上公认的、广泛采用的评价医疗器械和医用材料溶血性的方法主要包括以下3 种：国家健康机构（National Institutes of Health,NIH）法[28]、ASTM F756[19]和日本卫生劳动及福利部（Ministry of Health,Labour and Welfare,MHLW）[29]方法。3种测试方法的主要异同如表4所示。

结合上述标准来看，我国目前检测及评价机构采用的测定方法，基本为参考NIH 法形成，与之相比略有微调，如阳性对照组采用注射用水，这种方法已经有研究证实是有效的[30,31]。3 种测试方法在样品-测试介质-血液的比例和接触时间上略有不同，对血液制备的要求和血源要求上也有所不同，但是在方法上都被证明可行性、可重复性好。最终溶血率的评价和计算上，原理也比较相似。但在这3种评价标准中，只有ASTM标准采用了D-PBS缓冲液作为测试介质，考虑到了pH值对溶血实验测定结果的影响，更符合人体内情况，而其他2 种方案仍采用的为NS 作为测试介质，这也是本次实验选取D-PBS 缓冲液作为改进方法的重要依据之一。使用NS作为测试介质是有历史原因的：其较容易获得，与血细胞组织相容性好。而在镁合金、铁合金、锌合金等可降解医用金属材料广泛进入视野之前，医用材料主要以耐腐蚀性较好的金属材料，如钛合金、不锈钢，和非金属材料，如有机硅材料为主，这些材料通过短时间的浸提和反应对测试介质液体离子浓度和pH值都不会造成比较大的影响，所以NS一直被作为标准的测试介质。

目前医疗“微创化”和“舒适化”需求不断提高，可降解材料将会更多出现在我们视野中，在降解过程中会引起pH 值改变的材料也会陆续出现，继续采用现行标准对此类材料进行评价显然是不合适的。所以对当前ISO10993.4标准及我国采取的GB/T16886.4标准中的溶血实验方法进行进一步明确和完善，综合考虑其降解过程中产生的其他影响，制定合适的测试方法尽量排除干扰因素，是接下来十分有意义的工作。

表4 三种溶血实验方法比较