脑泰通方对糖尿病合并出血性脑卒中大鼠血清IL-1、ICAM-1的影响∗

谢 军 李 军

（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000）

脑出血是严重危害人类健康的疾病，具有极高的致残率、发病率、死亡率，糖尿病作为其中的危险因素，在脑出血期间病情往往更加严重。糖尿病患者合并急性脑出血往往病死率高，康复过程延缓，预后差，中医药在此病的治疗上具有独特的优势，受到临床工作者的关注。本文作者李军教授根据多年的临床经验，发现运用脑泰通方加减治疗糖尿病合并脑出血的患者，能够有效改善肢体活动障碍等后遗症，且大多数患者都收到良好的疗效。本研究采用脑泰通方治疗糖尿病脑出血大鼠，观察大鼠的神经功能改善、相关炎性因子的改变，探讨其发病及治疗机制，以期为临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康Ⅰ级SD大鼠96只，雌雄各半，体质量（280±20）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCGY（川）2015-030，适应性饲养1周，正常饮食、水，及时更换垫料，营造良好的生活环境。为防止鼠类交配，注意将雌雄大鼠隔开安置。

1.2 试药与仪器

脑泰通方，组成：丹参15 g，姜半夏12 g，淡竹茹10 g，炒枳实10 g，桔梗12 g，茯苓12 g，广陈皮12 g，水蛭 6 g，地龙 10 g，菖蒲 12 g，蝉蜕 10 g，龙脑 0.1 g（冲服）。药材制成含生药2 g/mL的浓缩水煎剂（陕西中医药大学制剂中心提供，批号20181023）。转轮式切片机（深圳永年科技有限公司）；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机（北京亚泰科隆电子仪器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋机（北京亚泰科隆电子仪器有限公司）；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（北京亚泰科隆电子仪器有限公司）；全自动酶标仪（美国Bio-TekELXSOSIU）；高速冷冻离心机（日本日立CR22GII）；脑立体定位仪（美国stoeting公司）；微量注射器（上海医学仪器厂）；牙科钻（深圳瑞沃德有限公司）；白细胞介素-1（IL-1）试剂盒（成都旭海润东生物科技有限公司，批号20180126542）；细胞间黏附分子-1（ICAM-1）试剂盒（成都旭海润东生物科技有限公司，批号2018042305）。

1.3 模型制备

1.3.1 糖尿病大鼠模型 参照STZ［1］诱导法，采用高能量饮食喂养（标准饲料中添加10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇）［2］，空腹12 h后，腹腔注射50 mg/kg STZ，注射STZ后2 d，再测空腹12 h的血糖，首次和3 d后两次随机血糖均≥16.7 mmol/L，即为造模成功［3］。

1.3.2 脑出血模型 用10%水合氯醛按0.4 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉糖尿病模型大鼠。剃刀清理头部毛发，然后将大鼠仰卧位固定于手术台，因鼠尾坚硬，不易分离，可先用温水提前浸泡下，充血后手术刀划开纵行小口，剥离韧带，用微量注射器快速取血约55 μL，即包扎开始固定。固定时应该注意正确的固定顺序是：先定耳间线，再定门齿。耳朵和眼睛之间，酒精消毒手术刀切开十字切口找到前囟（约1 cm），使前后囟保持一条直线，提前查找相关的动物脑立体定位图（坐标：前囟前0.25 mm，右旁开3.45 mm，深度6 mm），记号笔在手术点标记“十”字符号，即为钻孔处，使用微型电动颅钻（钻头尖端直径1 mm），右手持钻，务必用左手托扶右手，因大鼠颅骨较薄，易钻透，深度以到骨膜为好，边钻边观察，适当情况下用针头探下，手下稍有落空感表明已经钻透。将取完血的微量注射器固定于定位仪上，注射时不宜过快，以10 μL/min速率均匀注射20 μL，留针5 min，再以同速注射剩存的35 μL。完成后，针头静置5 min后迟缓退针。退针后，针孔用无菌骨蜡封闭，确认无出血后，碘酒消毒缝合大鼠头部皮肤，使用青霉素喷于手术部位防止感染，并将大鼠置于恒温垫上复苏，恒温垫温度维持37℃，待苏醒后放回笼子。

1.4 分组及用药

采用随机法将大鼠均分为4组，即空白组、假手术组、模型组、脑泰通方组。造模成功24 h后开始给药。空白组、假手术组及模型组灌胃生理盐水2 mL/100 g，脑泰通方灌胃药液2 mL/100 g，每日早晚2次，持续1周。

1.5 标本采集与检测

大鼠苏醒后，各组分别在6 h、24 h、3 d、7 d取6只大鼠，进行神经功能缺损程度评分及采血检测。1）神经功能缺损程度。大鼠苏醒后进行神经行为学评分，评分标准参照Bederson［4］法，总分0～4分，数值越高，缺损功能越严重。2）各组大鼠血清中IL-1、ICAM-1含量。术前禁食12～24 h，用新鲜配制的10%水合氯醛麻醉各组大鼠（按0.4 mL/100 g注射量），固定四肢于手术台，消毒手术处，于前胸剪开，充分暴露胸腔腹腔，剥离器仔细剥离血管神经，找到腹主动脉，采血针垂直进针，止血钳夹血流上源，将采血针末端插入真空管，松止血钳，采集后及时夹闭腹主动脉下端，EP管置于恒温水浴锅37℃待离心，全部取血完毕后，取血管放置3 000 r/min的离心机中，10 min离心完毕后移液枪取上清液至50 mL EP管，并将其放置-80℃冰箱中冷冻，待测。将ICAM-1、IL-1抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或者样本，其中的ICAM-1、IL-1连接于固相载体上的抗体结合，然后彻底洗涤后加入ICAM-1、IL-1抗体，将未结合的生物素抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ICAM-1、IL-1呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.6 统计学处理

应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）表示，采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模情况

造模全部结束后，依据Bederson评分，剔除3只，不计入本实验。术前死亡2只，因麻醉操作不妥或过多致死；术中死亡7只，因术中颅脑钻操作不妥，致失血过多致死；术后死亡5只，因伤口裂开、同类撕咬、或传染致死。实验中96只大鼠，均分为4组，每组24只，因造模等各种情况损失的大鼠，自动由空白大鼠补充，保证各组数量相同。

2.2 各组大鼠一般状况

同一批号的大鼠购进时，活动自如，屈伸有力，反应迅速，毛色亮白，饮食无异常。特殊饲料喂养后，大鼠体质量明显增加，喜静恶动，毛色淡黄，粪便臭秽黏滞，STZ注射后1周，大鼠“三多”症状表现显著，体质量有所降低，出现皮毛色泽晦暗无光泽，目光呆滞，爬行无力等症状。行脑出血造模后，左侧后肢体瘫软，左前肢抬举无力，不能直线，呈转圈状态，行动迟缓，不能攀爬，舌质紫黯，舌下紫胀瘀点、瘀斑。连续灌胃7 d后，给药组大鼠精神活跃，毛色渐见光泽，进食尿量均有所减少，体质量略有回升，活动度好转，左前爪弯曲，偶有抓须动作，左后肢无力有所改善，轻微屈曲移动，舌质紫黯，翻舌底瘀青、瘀斑，较服药前改善。

2.3 各组大鼠神经功能缺损评分比较

见表1。与模型组比较，在6 h与12 h假手术组评分明显降低（P<0.01），可能因为术中创伤、麻醉过多导致。模型组、脑泰通方与空白组差异具有统计学意义（P<0.01）；假手术组与空白组无统计学差异（P>0.05）；模型组与脑泰通方组在各时间段均有明显差异（P<0.05）。

表1 各组大鼠Bederson评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠Bederson评分比较（分，±s）

与模型组比较，∗P<0.05，∗∗P<0.01；与空白组比较，△P<0.01。下同

组别空白组假手术组模型组脑泰通方组n 24 24 24 24 6 h 0.00±0.00**0.81±0.40**2.53±0.23△2.02±0.42*△24 h 0.00±0.00**0.81±0.40**2.73±0.23△2.22±0.62*△3 d 0.00±0.00**0.00±0.00**2.84±0.23△2.18±0.42*△7 d 0.00±0.00**0.00±0.00**2.62±0.23△2.11±0.41*△

2.4 各组大鼠血清中IL-1含量比较

见表2。空白组与假手术组较无明显差异（P>0.05）；模型组与空白组均有显著差异（P<0.01），提示造模成功；脑泰通方组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），提示用药后对于IL-1水平有降低作用。

表2 各组大鼠不同时间段血清中IL-1水平比较（ng/L，±s）

表2 各组大鼠不同时间段血清中IL-1水平比较（ng/L，±s）

组别空白组假手术组模型组脑泰通方组n 24 24 24 24 6 h 67.62±9.32**68.56±10.21**86.32±7.47 80.21±5.42*△24 h 67.62±8.32**68.86±9.31**94.56±9.48 85.24±7.71*△3 d 67.63±11.96**66.87±8.56**99.24±7.25 92.46±10.54*△7 d 66.53±8.35**67.21±11.87**97.56±6.14 91.32±7.69*△

2.5 各组大鼠血清中ICAM-1含量比较

见表3。空白组与假手术组比较，无明显差异（P>0.05）；模型组与空白组差异均有统计学意义（P<0.01），提示造模成功；模型组与脑泰通方组有统计学差异（P<0.05），提示脑泰通方对于ICAM-1具有降低作用。

表3 各组大鼠不同时间段血清中ICAM-1含量比较（ng/L，±s）

表3 各组大鼠不同时间段血清中ICAM-1含量比较（ng/L，±s）

组别空白组假手术组模型组脑泰通方组n 24 24 24 24 6 h 34.92±7.10**35.10±4.25**67.89±7.24 59.62±8.54*△24 h 34.92±7.10**35.11±8.26**86.46±10.54 80.21±11.20*△3 d 34.92±6.97**35.16±3.47**98.24±9.25 93.64±9.56*△7 d 34.92±7.10**35.14±9.10**98.26±13.10 91.24±7.56*△

3 讨论

对于脑出血的治疗，本文作者李军提出了“痰瘀学说”，在此病治疗上引出了很好的辨证思路，强调“瘀血阻滞，脉道不利”［5］。中医认为［6］瘀血既为脑出血之病理基础，又为脑出血之病理产物，脑出血急性期应给予活血化瘀治疗。“瘀血不去则新血不生”，祛瘀血能减少对脑髓的压迫，促进脑髓功能的恢复，防止痰浊、水肿、毒邪等对脑髓造成损伤，使被压迫的脑络气血运行正常，挽救受损的脑髓。李军教授将痰瘀学说结合现代药理学研究，创立脑泰通方，其中丹参、姜半夏为君，祛瘀生新，燥湿化痰，两者合用涤痰祛瘀之功倍增。陈皮、半夏相须为用，此二陈除痰饮，理中气，兼燥湿，体现气顺痰消之机要；竹茹清热化痰和胃，助君药之效；桔梗宣肺化痰，载药上行头目；枳实辛散苦降，配以桔梗一升一降，调达气机，相得益彰；茯苓淡脾利湿，使下行有路、水蛭破血逐瘀；地龙通络，去顽痰，合用助涤痰通络之力，以石菖蒲、蝉蜕为佐，芳香醒神，开窍启闭；蝉蜕轻开散上，相辅相成，开窍之功增强。冰片为使药，引诸药上行达脑，使血脉畅达。现代药理也为中药治疗提供了理论依据。临床上采用丹参川芎嗪注射液联合黄芪治疗糖尿病脑功能减退的患者，大多数都收到了良效［7］。结果表明，丹参提取物具有促进血液循环的作用，可通过清除血管中的代谢废物以及血管壁上的脂质沉积，改变血液通畅度［8］，对于脑缺血损伤、脑组织微循环起到保护和修复作用。水蛭是活血化瘀方案常用的药物。有研究证实［9］，水蛭活性成分含有的凝血酶抑制成分可能具有阻止凝血酶诱发脑水肿的形成的作用。水蛭配合丹参，共同参与改善血流变学，同时对于炎症通路中的各类因子均有拮抗的作用，还作为血管的清道夫，清除血管中的免疫复合物，间接保护血管。陈皮含有多糖成分，可双向调节糖脂代谢、阻止脂肪肝进一步的加重，且具有抗氧化、清除自由基作用，可以调控平衡性激素的含量，从而调动免疫系统抵抗潜力［10］。临床研究证明［11］，石菖蒲在改善记忆功能方面，常与远志配合作为对药，发挥出“1+1>2”的效果，通过加强神经突触，增强AchE活性，使得大鼠在水迷宫项目中有良好的记忆功能体现。同时结果表明［12］，冰片对脑外伤大鼠脑组织有保护，促进血脑屏障（BBB）开放。冰片常常作为促透剂，能直达病灶，这与中医中引经药概念不谋而合。本研究应用的脑泰通方多数虽为活血化瘀药，表象看似与脑出血的治疗原则相违背，但是本研究模型凝血机制正常，仅由于血管破裂，血流动力学改变，活血药在此促进局部的血液循环，阻止血肿的进一步扩大，压迫，促进并建立其他的侧支循环，使肿胀更好地吸收，使后遗症能降到最小，改善神经缺损症状。

王琪等［13］认为，急性脑损伤后病理进程与全身性抗炎反应，包含抗炎性细胞因子的开释密切相关。脑损伤后炎症细胞成分的聚积可驱引炎症前细胞因子、化学因子、内皮细胞和白细胞黏附因子的表达上调［14］。有研究报道［15］，脑出血后血肿周围脑组织以及各种特化的神经支持细胞，产生释放大量的炎性细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）出现炎性细胞浸润，加剧脑组织的水肿压迫，导致周围组织缺血缺氧、无氧代谢产生乳酸，堆积形成酸中毒，从而形成恶性循环。

IL-1与ICAM-1在炎症反应、免疫反应、凝血和血小板构成以及保持正常内皮细胞，尤其脑外伤后的病理生理过程中都起着不可忽视的作用［16］。当脑出血发生时，Caspase-1被激活，进而将无活性的IL-1β前体裂解为活性形式，不仅能够介导早期炎性反应，诱导兴奋性氨基酸，造成神经功能损伤，此外，也能造成级联放大炎症过程，诱导其他炎性介质、黏附分子的产生［17］。当炎症蔓延时，ICAM-1介导大量白细胞趋化并聚集，其他毒性因子趋化黏附，进一步加重脑水肿的缺氧。而内皮细胞所产生PG2等保护因子能力下降，血脑屏障受损，大量毒性因子进入脑组织，最终导致脑细胞凋亡［18-19］。本实验结果中，糖尿病合并出血性卒中大鼠模型的左侧偏瘫肢体运动及肌力在用药后7 d时有改善，同时血清中的IL-1、ICAM-1水平显著降低（P<0.05）。

本研究提示脑泰通方可能通过大量活血成分改善血流动力学，促进脑出血后血肿部位的血液循环，阻止脑水肿的进一步扩大、压迫，降低血糖水平，减少炎症通路中的各类因子对脑组织破坏，通过清除自由基及血管中的代谢废物，保护血管，从而间接保护脑组织，改善相关的神经缺损症状。