Notch1信号通路激活在低氧诱导人脐静脉内皮细胞血管形成中的作用

Notch信号通路由4个Notch受体（Notch 1-4）和5个相关的Notch配体（Jagged 1、Jagged 2、Dell 1、Dell3和Dell4）组成[1]。Notch信号蛋白参与细胞增殖、迁移和细胞间黏附等多项生物活动。据报道，Notch信号通路的大多数组分在血管内皮中表达，尤其是Notch1受体[2]。此外，Notch1受体已被证明是血管发育中最重要的Notch 受体，而Dell4和Jagged1是Notch1受体的主要配体[3]。Dell4 在血管生成中发挥重要作用，据报道，Dell4 缺陷可导致炎症的血管重塑障碍及小鼠胚胎死亡[3]。虽然多项研究表明Notch1、Dell4和Jagged1在胚胎血管生成中起着重要作用[4]。然而，目前尚不清楚低氧对胎盘血管生成的影响是否与Notch1 及其配体有关。因此，本研究将人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）在低氧条件下培养以模拟早期胎盘的低氧环境[5]，应用Notch1信号通路的抑制剂DAPT和激活剂JAG-1 观察Notch1信号通路对HUVEC迁移和血管形成能力的影响。

材料与方法

一、试剂和仪器

HUVEC（中国典型培养物保藏中心）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；Matrigel基质胶（354234）、DAPT和JAG-1（美国BD Pharmingen公司）；Trizol试剂（15596-018）（美国Invitrogen公司）；M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒（M1701）[普洛麦格（北京）生物技术有限公司]；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix（QPK-201）

（日本TOYOBO公司）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒（P0012S）购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体（英国Abcam公司）；超敏ECL 化学发光试剂盒（ECL-P-100）（上海炎熙生物科技有限公司）；MTT试剂盒（HZB0375）（美国Sigma公司）。

二、方法

（一）细胞处理

将HUVEC进行常氧和低氧[200 μmol/L，二氯化钴（CoCl2）]诱导。再将常氧和低氧处理的HUVEC应用Notch1信号通路的抑制剂DAPT（30 μmol/L，24 h）和激活剂JAG-1（30 μmol/L，24 h）干预。DAPT和JAG-1 用0.1﹪的二甲基亚砜溶解，并配置成指定浓度。细胞处理流程见图1。

（二）细胞培养

将HUVEC 在37℃、5﹪ CO2环境中培养。培养基为含有10﹪胎牛血清和终浓度为0.1﹪二甲基亚砜的RPMI 1640培养基，培养期间每周更换2次或3次。含有二氯化钴（CoCl2，200 μmol/L）的培养基用于细胞的低氧诱导[6]。

（三）小管形成测定

使用300 μL Matrigel 基质胶涂覆24孔板进行铺胶，然后在37℃静置30 min。将HUVEC分别用30 μmol/L的DAPT或JAG-1处理24 h。然后将HUVEC（1×105/孔）接种到每个孔中，并在37℃下孵育24 h。然后应用Image-Pro Plus 图像分析软件计算小管总长并用Nikon 倒置相差显微镜拍摄照片（×100）。实验重复3次。

（四）RNA提取和RT-PCR

用Trizol试剂根据生产厂商的说明从HUVEC中提取总RNA。使用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒将总RNA（1 μg）反转录成cDNA。引物序列如表1所示。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（QPK-201）在Mx3000pTM实时荧光定量PCR 仪上进行RT-PCR。反应体系为20 μL，其中包括1 μL引物、10 μL MixSYBR、1 μL cDNA和6 μL H2O。反应条件如下：95℃ 5 min，95℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。GAPDH作为内参基因。使用2-△△Ct方法进行mRNA 相对表达量的计算。实验重复3次。

图1 HUVEC细胞处理流程

表1 引物序列信息

（五）Western blot检测

将收集的细胞在300 μL裂解缓冲液中置于冰上裂解30 min，并将裂解液以10 000 ×g在4℃下离心15 min。使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并将蛋白质在100℃变性5 min。通过10﹪SDS-PAGE 分离蛋白质（40 μg），然后在转移缓冲液中于4℃转移至PVDF膜2 h。洗涤后，将膜用5﹪脱脂乳在室温下封闭60 min。然后将膜在4℃下与以下一抗孵育过夜：Notch1（ab194123，1:2 000）、Dell4（ab23673，1:1 500）、JAG-1（ab7771，1:2 000）、HIF-1α（ab51608，1:3 000）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（ab222510，1:1 000）、MMP-9（ab141579，1:3 000）和GAPDH（ab181602，1:2 000）。然后在室温下将膜与二抗抗兔抗体（ab6721，1:3 000）孵育90 min。然后通过超敏ECL 化学发光试剂盒（ECL-P-100）进行显影。GAPDH作为内部对照，将靶蛋白条带的相对密度标准化为GAPDH并计算相对表达量。

（六）Transwell迁移实验

先将HUVEC分别用30μmol/L的DAPT或JAG-1处理24 h。再将Transwell 小室插入24孔板中，向Transwell小室中加入100 μL HUVEC（1×104/孔），置于37℃、5﹪ CO2的培养箱培养1 h。将上室培养基更换为含有1﹪FBS的条件培养基，下室更换为含有15﹪FBS的普通培养基。后置于37℃、5﹪CO2培养箱中培养12 h。用棉签刮去上室未迁移细胞，并将小室用多聚甲醛固定15 min，然后结晶紫染色15 min，显微镜下观察迁移细胞并计数。每组实验重复6次取平均值。

（七）伤口愈合实验

细胞接种在6孔板中并用无菌100 μL 枪头在细胞生长中央区域划线。再分别将10 μL DAPT（30 μmol/L）或JAG-1（30 μmol/L）加入培养基中，对照组细胞加入10 μL PBS。通过倒置相差显微镜在0 h和24 h 捕获伤口图像，使用Image J 软件评估伤口面积。

（八）MTT法测定细胞增殖

使用MTT 测定法检测细胞增殖，将HUVEC分别用30 μmol/L的DAPT或JAG-1处理24 h后，将细胞按每孔1×105接种到96孔板中，培养48 h后，分别向每个孔中加入20 μL 5 g/L的MTT 并孵育4 h。弃去上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜并搅拌15 min。使用SpectraMax M5多功能酶标仪检测488 nm处的吸光度。

三、统计学分析方法

采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，小管总长、HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表达、Notch1、Dell4和JAG-1mRNA和蛋白表达、迁移细胞数、迁移距离、MTT法测定细胞增殖实验中488 nm处的OD值检测结果均以表示。两组间比较采用t检验，采用析因设计方差分析低氧和DAPT以及低氧和JAG-1对HUVEC迁移能力、距离、小管形成能力和细胞增殖的交互作用。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、常氧及低氧处理HUVEC后小管形态与长度比较

与常氧比较，低氧小管总长（8.18±0.62）mm 比（15.43±1.32）mm 增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。常氧中的“管道样”小管结构较少且长度较短，而低氧的细胞相互连接，“管道样”结构小管增多增长，血管腔完整性较好（图2）。

二、常氧和低氧处理HUVEC后HIF-1α、VEGF和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平比较

与常氧比较，低氧的HIF-1α、VEGF和MMP-9的mRNA 相对表达量和蛋白相对表达量均升高，差异有统计学意义（P均＜0.05，表2，图3）。

三、常氧和低氧处理HUVEC 中Notch1信号的mRNA和蛋白表达水平比较

与常氧比较，低氧Notch1、Dell4和Jagged1的mRNA 相对表达量和蛋白相对表达量均升高，差异有统计学意义（P均＜0.05，图4，表3）。

表2 HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的蛋白相对表达量（±s，n = 6）

表2 HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的蛋白相对表达量（±s，n = 6）

注：HIF-1α为低氧诱导因子-1α；VEGF为血管内皮生长因子；MMP-9为基质金属蛋白酶-9；n为实验重复次数

分组 HIF-1α mRNA VEGF mRNA MMP-9 mRNA HIF-1α蛋白 VEGF蛋白 MMP-9蛋白images/BZ_44_987_2879_988_2880.png常氧 1.01±0.03 1.02±0.03 0.98±0.04 1.01±0.03 0.99±0.02 1.02±0.04低氧 4.43±0.35 3.55±0.28 3.24±0.25 3.22±0.25 2.89±0.22 2.43±0.19 t 值 13.768 11.353 11.769 9.746 8.642 5.749 P值＜0.001＜0.001＜0.001 0.002 0.009 0.019

图2 倒置相差显微镜下观察HUVEC细胞Matrigel 小管形成能力（×100）

图3 Western blot检测HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的蛋白表达

图4 Western blot检测HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的蛋白表达

四、HUVEC的迁移细胞数和迁移距离比较

（一）HUVEC的迁移细胞数

低氧提高HUVEC迁移细胞数（F= 138.754，P＜0.001），而DAPT 降低HUVEC迁移细胞数（F= 409.246，P＜0.001），低氧和DAPT 交互效应差异无统计学意义（F= 1.049，P= 0.336，表4）。低氧和JAG-1均提高HUVEC迁移细胞数（F= 263.776，P＜0.001；F= 227.439，P＜0.001），低氧和JAG-1 交互效应具有协同作用（F= 43.215，P＜0.001，表4）。Transwell迁移实验结果如图5所示。

（二）HUVEC的迁移距离

低氧提高HUVEC迁移距离（F= 72.600，P＜0.001），而DAPT降低HUVEC迁移距离（F= 123.267，P＜0.001），低氧和DAPT交互效应差异无统计学意义（F= 0.067，P= 0.803，表5，图5）。低氧和JAG-1均提高HUVEC迁移距离（F= 73.000，P＜0.001；F= 200.562，P＜0.001），低氧和JAG-1 交互效应差异无统计学意义（F= 0.342，P= 0.575，表5）。伤口愈合实验结果如图6所示。

五、HUVEC的小管形态和小管总长比较

低氧提高HUVEC的小管总长（F= 15.902，P= 0.004），而DAPT 降低HUVEC的小管总长（F= 8.051，P= 0.022），低氧和DAPT 对小管形成能力的交互效应差异无统计学意义（F= 3.984，P= 0.081，表6）。低氧和JAG-1均提高HUVEC的小管总长（F= 22.514，P= 0.001；F= 17.277，P= 0.003），低 氧和JAG-1的交互效应具有协同作用（F= 7.348，P= 0.027，表6）。HUVEC的小管形成实验结果如图7所示。

表3 HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的蛋白相对表达量（±s，n = 6）

表3 HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的蛋白相对表达量（±s，n = 6）

注：n为实验重复次数

分组 Notch1 mRNA Dell4 mRNA Jagged1mRNA Notch1蛋白 Dell4蛋白 Jagged1蛋白常氧 0.98±0.01 0.98±0.02 0.97±0.03 1.01±0.03 1.00±0.04 1.03±0.05低氧 3.13±0.24 2.67±0.21 2.45±0.19 2.44±0.19 2.30±0.18 2.27±0.18 t 值 11.146 7.647 7.112 4.793 4.520 4.438 P值＜0.001 0.004 0.008 0.022 0.027 0.033

表4 低氧及DAPT、JAG-1对HUVEC迁移细胞数的影响（个，x±s）

图5 倒置相差显微镜下观察HUVEC细胞Transwell迁移实验（结晶紫染色，×200）

表5 低氧及DAPT、JAG-1对HUVEC迁移距离的影响（mm，x±s）

图6 倒置相差显微镜下观察不同组0和24 h HUVEC细胞伤口愈合（×100）

六、HUVEC的细胞增殖能力比较

低氧提高HUVEC的小细胞增殖（F= 54.914，P＜0.001），而DAPT 降低HUVEC的细胞增殖（F= 78.229，P＜0.001），低氧和DAPT 对细胞增殖的交互效应差异无统计学意义（F= 0.914，P= 0.367）。低氧和JAG-1均提高HUVEC的细胞增殖（F= 160.013，P＜0.001；F= 98.299，P＜0.001），低氧和JAG-1的交互效应具有协同作用（F= 21.831，P= 0.002）。（表7）

表6 低氧及DAPT、JAG-1对HUVEC 小管总长的影响（mm，x±s）

图7 倒置相差显微镜下观察HUVEC的小管形成（×100）

表7 低氧及DAPT、JAG-1对HUVEC细胞增殖的影响（488 nm OD，x±s）

讨 论

血管系统的形成是影响人胎盘发育和功能的最早和最重要的事件之一，这是成功怀孕和胎儿生长的先决条件。人胎盘血管网络的建立是一个非常复杂的过程，血管发生和血管生成是血管系统发育的两个重要过程，血管发生之后的血管生成过程涉及血管的出芽、内填和延长三个步骤[7]。氧分压、氧化应激、活性氧、炎症因子等均可引起胎盘功能障碍，并且与血管生成因子和抗血管生成因子之间的不平衡密切相关[8]。越来越多的证据表明，人体胎盘的血管系统紊乱在先兆子痫、胎儿宫内生长受限、复发性自然流产、胎儿窘迫等妊娠疾病中发挥关键作用[9]。因此，理解胎盘血管发生和血管生成过程中涉及的机制对正常受孕和胎儿生长具有重要意义。

胎盘的正常发育与胎盘血管生成密切相关，而氧分压是血管生成调节的关键因素。氧分压异常可能导致人胎盘中的各种血管生成异常，从而导致先兆子痫、流产、早产等病理性妊娠的发生[10]。在妊娠早期阶段，由于子宫螺旋动脉为闭塞状态且胎盘循环尚未完全建立，因此此时的胎盘约在2﹪～8﹪ O2的低氧调节下发育[11]。据报道，低氧能够促进毛细血管的形成及内皮细胞的迁移[12]。本研究通过测试HUVEC的体外小管形成来模拟低氧条件下HUVEC的血管生成能力。研究发现常氧条件下HUVEC形成“管道样”小管结构较少且长度较短，而低氧条件可促进“管道样”结构小管的生长。此外，本研究通过Transwell迁移实验和伤口愈合实验评估了低氧对HUVEC的迁移能力的影响。研究发现，低氧显著提高了HUVEC的迁移能力。上述研究结果与前人报道一致，即一定程度的低氧可促进胎盘血管生成及内皮细胞迁移。

HIF-1α是细胞对低氧反应的主要调控因子，HIF-1α 在人体内广泛存在[13]。低氧条件可导致HIF-1α 高表达，并激活其下游低氧反应基因来调节血管生成、细胞生成和凋亡等一系列生理过程[14]。据报道，HIF-1α 可调控编码VEGF的基因转录，从而维持细胞内环境稳定[15]。低氧导致HIF-1α 上调，然后HIF-1α 与VEGF 启动子中的低氧反应元件结合并上调其表达水平，进而增加血管的通透性并促进血管形成[16]。VEGF是新血管生成中的重要信号蛋白，主要由由刺激血管生成的细胞产生。VEGF的激活可促进血管内皮细胞生长、转移、存活以及血管的渗透性[17]。并且，VEGF的活化与胎盘血管形成密切相关。有研究发现，低氧可上调绒毛膜滋养层细胞的VEGF 水平，而氧分压过高则会抑制VEGF的表达[18]。本研究应用RT-PCR和Western blot检测了低氧处理对HUVEC 中HIF-1α、VEGF和MMP-9的mRNA和蛋白表达的影响。研究发现低氧处理均可显著上调HUVEC 中HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。表明低氧诱导的HUVEC 血管生成可能通过上调HIF-1α和VEGF 来介导。

近年来，人们越来越关注Notch信号传导途径在胎盘发育中的作用。Notch信号通路在进化过程中高度保守，并且在细胞生长过程中发挥关键作用。其他研究人员发现通过切除小鼠Notch1、Dell4或JAG-1 基因可导致血管严重紊乱和血管重塑障碍，从而引起胚胎死亡[19]。Notch信号成员在人胎盘中广泛表达，尤其是Notch1、JAG-1和Dll4。此外，Notch信号分子是VEGF的下游靶基因，VEGF可通过激活Notch信号通路来促进新生血管形成。有研究报道，在小鼠胚胎模型中注射VEGF的激活剂可上调VFGF的表达，进而诱导Notch信号通路相关因子的活化并促进血管生成[20]。本研究应用RT-PCR和Western blot检测了低氧处理对HUVEC中Notch1信号分子的mRNA和蛋白表达的影响。研究显示低氧处理均可显著上调HUVEC 中Notch1、Dell4和Jagged1的mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。表明低氧可通过上调VEGF的表达进而激活Notch信号通路来促进胎盘血管生成。

各种研究表明，γ-分泌酶抑制剂（GSIs）如DAPT 可以有效阻断Notch 受体的切割和信号转导，相反，作为JAG-1的可溶性肽片段，JAG-1 可用于激活Notch信号传导途径[21]。为了进一步验证Notch信号通路在HUVEC 血管生成中的作用，本研究分别应用Notch1信号通路的抑制剂（DAPT）和激活剂（JAG-1）来处理HUVEC。研究发现DAPT处理显著抑制了低氧诱导的HUVEC的小管形成、迁移和增殖能力，而JAG-1处理则进一步提高了HUVEC的小管形成、迁移和增殖能力（P＜0.05）。进一步证实了低氧通过激活Notch1信号通路来促进胎盘血管生成。此外，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在细胞的生长和血管生成中发挥重要作用，MMP-9 不仅参与肿瘤细胞的转移，而且与胎盘血管生成和内皮细胞迁移有关[22]。本研究发现低氧处理显著上调HUVEC 中MMP-9的mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。提示低氧对HUVEC的迁移能力的促进作用可能通过MMP-9 介导。

综上所述，本研究表明低氧可通过激活HIF-1α/VEGF/Notch1信号通路显著提高HUVEC的血管生成能力、迁移能力和增殖能力，从而促进胎盘血管生成。