Hippo-YAP/TAZ信号通路在干细胞增殖、分化及器官再生中的研究进展

干细胞（stem cell，SC）是一类具有自我更新和分化潜能并能够保持未分化状态的细胞，包括可以无限增殖并分化成所有细胞类型的全能干细胞（totipotent stem cell，TSC），分化成某些特定组织器官的多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）和存在于成体组织器官中，当组织损伤时可被活化的成体干细胞（adult stem cell，ASC）[1]。SC对组织器官生长发育、修复极为重要，可作为基因治疗的理想载体及体外药物研究的靶细胞。机体存在多条重要信号通路调节SC存活、增殖和分化，其中包括Hippo信号通路。虽然此通路机制尚未完全阐明，但它可通过其下游因子YAP/TAZ或与其他信号通路等相互作用在SC自我更新、增殖、组织分化及器官发育中发挥重要作用。本文就Hippo-YAP/TAZ信号通路在调控SC自我更新、增殖、重编程、分化及器官再生过程中的相关机制作一综述。

一、Hippo-YAP/TAZ信号通路及其交互作用通路

（一）Hippo-YAP/TAZ信号通路

Hippo-YAP/TAZ信号通路在控制器官大小和抑制肿瘤发生中具有协调细胞存活、增殖、凋亡和分化的功能。哺乳动物Hippo-YAP/TAZ信号通路的核心成分由一个激酶链组成，通过MST1/2磷酸化SAV1，两者结合使MOB1A/B和LATS1/2磷酸化，进而磷酸化YAP/TAZ 使其与14-3-3磷酸肽结合滞留在细胞质，通过蛋白酶体降解而失活[2]。相反，在Hippo信号失活情况下，去磷酸化的YAP/TAZ 在细胞核中积累，可与VGLL4 竞争结合转录因子TEAD形成转录复合物，激活下游靶基因，如结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、CyclinE、CDK1和MYC等促进细胞增殖或肿瘤生长，也可通过影响八聚体结合蛋白-4（octamer-bindingprotein-4，Oct4）、性别决定区Y 框蛋白2（sex determining region Y-box 2，Sox2）、Nanog 基因的表达调节SC多能性[3]。此外，YAP/TAZ 也可以与其他转录因子结合，如p73、Runx1/2、Smad和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptorsγ，PPARγ）等，但其详细功能和调剂机制尚不完全清楚[4]。

（二）Hippo-YAP/TAZ信号通路与Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin通路也参与细胞增殖、分化及器官生长发育过程。Wnt被激活时促进β-catenin 入核，通过与T细胞因子（T-cell factor，TCF）或淋巴增强因子（lymphoid enhancing factor，LEF）结合激活下游靶基因的表达，Wnt/β-catenin通路与Hippo-YAP/TAZ通路存在相互作用。在对小鼠肾脏的研究中发现，当Hippo信号失活时，核TAZ表达增加，使TAZDVL 结合减少导致Wnt 刺激的DVL2磷酸化增加，促使β-catenin 核积累和靶基因的表达，并且，TAZ 敲除可能导致Wnt/β-catenin通路过度激活引起小鼠多囊肾的产生[5]。在心脏中，核YAP通过与β-catenin 结合，促进心脏发育相关基因的表达，当Hippo信号失活，核YAP 与β-catenin 会大量累积，造成心肌过度生长[6]。研究表明，Wnt3a可抑制TAZ 降解，导致成骨细胞分化[7]，并且YAP 可通过增加核β-catenin的表达促进成骨细胞形成[8]。由此可见，Hippo-YAP/TAZ与Wnt/β-catenin信号通路通过相互制约确保肾脏、心脏和骨骼等组织器官正常生长发育，而在其他组织器官中的相互作用及功能需进一步研究。

（三）Hippo-YAP/TAZ信号通路与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad通路

TGF-β通路参与细胞生长、凋亡、分化、迁移和机体代谢等过程，并在癌症等疾病的发生发展中起作用。TGF-β家族配体通过与细胞表面Ⅱ型和Ⅰ型跨膜受体结合，Ⅱ型受体通过自磷酸化形式磷酸化Ⅰ型受体，激活的Ⅰ型受体通过磷酸化C 末端2个丝氨酸激活效应物Smads，并与Smad4 结合形成复合物易位到细胞核中，调节靶基因的表达。当Hippo信号被抑制时，TGF-β处理可促使YAP/TAZ与Smad蛋白在核内形成复合物，影响干细胞多能性、增殖和谱系分化相关基因的表达。研究发现，YAP/TEAD/Smad3/p300复合物可驱动CTGF表达，促进肿瘤细胞生长。YAP、Smad2/3和TEAD 会聚在一起调节TGF-β诱导的转录程序，影响促纤维化基因的表达[9]。进一步发现，RASSF1A 降解可以促使YAP 与Smad2 相互作用，促进Smad2 核易位和TGF-β 反应靶标的转录，导致癌细胞入侵[10]。总之，TGF-β 与Hippo信号之间通过相互作用可影响细胞的状态，促进纤维化和癌症的发生。

除以上通路外，Hippo-YAP/TAZ信号通路与其他通路（包括Shh、NF-κB和Ras 等）的交互作用也参与细胞生长、增殖和死亡过程。

二、Hippo-YAP/TAZ信号通路与SC

（一）Hippo-YAP/TAZ信号通路与SC多能性、增殖和存活

Hippo-YAP/TAZ信号通路可调节SC多能性及增殖。小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mESC）中白血病抑制因子通过激活细胞质酪氨酸激酶磷酸化YAP，并与TEAD2 结合提高干性基因Oct3/4和Nanog 启动子的活性，维持mESC多能性[11]。与此类似，在哺乳动物神经干细胞（neural stem cell，NSC）中，依赖TEAD的Hippo-YAP/TAZ信号通过抑制肿瘤抑制因子NF2和BMP2-SMAD信号通路，促进细胞的自我更新和增殖，从而影响大脑发育[12]。此外，物理作用下细胞接种密度的增加，在影响细胞之间相互接触及细胞表面肌动蛋白骨架的同时促使YAP 从细胞核转移至细胞质，使YAP-TEAD 转录活性下降，导致靶基因表达下调[13]，在PSC、NSC 等细胞的自我更新中具有关键作用。然而，也有研究报道敲除YAP后，mESC 依然能够保持未分化状态仍具多能性，但其分化潜能受到明显抑制[14]。进一步对NSC 及肠SC 等研究发现YAP 对其增殖不是必须的。SC处于自我更新状态时细胞凋亡会增加，从而影响细胞后续的分化，因此，Hippo信号如何调节SC 凋亡是值得研究的。最近研究发现，YAP 与p300 在通过物理作用结合的同时与TEAD 结合调节细胞促凋亡因子（如Bmf、Bbc3）和抗凋亡因子（如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1）之间的平衡，影响线粒体的状态，抑制mESC分化过程中细胞的大量凋亡，甚至维持ASC的存活[15]。基于此，可进一步研究人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）凋亡过程中Hippo信号的作用。

近些年，由于再生医学和组织工程学的发展，PSC的研究受到广泛关注。随着对小鼠胚胎发育过程研究的深入，Nichols 等[16]提出了PSC 不同的两种多能性状态：幼稚态（Naïve）和启发态（Primed）。Naïve表现出完全的多能性，Primed表现出有限的多能性，多能性因子Oct4、Sox2和Nanog 维持两者平衡。转录因子Notch3，糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）等可激活Wnt通路促进Naïve时多能性基因的表达，抑制Primed时多能性基因的表达。并且抑制GSK3β的同时激活YAP 可在一定程度上维持Wnt信号活性来维持Naïve。此外，研究发现TAZ通过与p-Smad2和Oct4 相互作用促进hESC自我更新，并发现mESC 从Naïve 转换为Primed时需要TAZ[17]。在细胞培养过程中加入溶血磷脂酸可以抑制LATS1/2活性，促使YAP激活，造成更多Naïve的PSC 产生[18]。也有研究显示YAP可能与碱性成纤维生长因子，TGF-β通路一起协作以维持Naïve的PSC，但结果还需进一步确认。

（二）Hippo-YAP/TAZ信号通路与SC重编程

科学家运用Oct3/4，Sox2，Krüppel 样因子4（krüppel-like factor4，Klf4）和c-Myc 四种转录因子成功产生了小鼠iPSC。之后通过重编程技术成功诱导成人成纤维细胞、平滑肌细胞、血液细胞和羊膜上皮细胞等体细胞产生人iPSC，为药物筛选及个体化细胞治疗提供了机会。但由于iPSC重编程效率的问题，使体外大规模生产iPSC 受到一定限制，Hippo信号的激活被认为是其中一大障碍。在人iPSC重编程过程中，LATS2 可通过抑制TAZ 来拮抗人类细胞的重编程。但是，单独抑制TAZ表达时，人iPSC形成效率仅有轻微降低[19]。另外，敲除MST1 可激活YAP表达，导致细胞增殖速率提高的同时降低细胞凋亡速率，提高成年小鼠皮肤成纤维细胞向iPSC的重编程效率[20]。因此可使用LATS2、MST1抑制剂进行与重编程相关的药理学研究。沉默信息调节因子2相关酶2（silencing information regulator 2-related enzyme 2，SIRT2）作为一种去乙酰化酶，可通过调节Hippo-YAP/TAZ信号通路中相关蛋白的表达，提高重编程过程中Naïve多能性细胞的产生，但对于SIRT2是否通过调节Hippo-YAP/TAZ信号通路来影响Naïve和Primed 相互转化需进一步分析[21]。与以上结论相反，诱导人羊膜上皮细胞重编程为iPSC 过程中Oct4、Sox2和YAP的过表达可造成MST、LAST1蛋白水平升高，缩短重编程时间，这可能是Hippo信号的一种反馈调节造成的[22]。

（三）Hippo-YAP/TAZ信号通路与SC分化

哺乳动物胚胎发育过程中，第一个分化过程是滋养外胚层（trophectoderm，TE）和内细胞团（inner cell mass，ICM）的分离。ICM是胎儿和ESC的祖细胞通过产生多能细胞，进一步分化成体内所有类型细胞，TE 则只负责产生胚外组织。因此，正确调节首次细胞分化事件十分重要，其中Hippo通路激酶LAST1/2 及转录共激活因子YAP 在此过程中起重要作用。研究发现，上游Hippo通路成员NF2、血管动蛋白（angiomotin，AMOT）通过影响激酶LATS1/2磷酸化YAP的方式，拮抗YAP/TEAD4 转录复合物的活性，抑制尾型同源框转录因子2（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）的表达并促进Sox2表达，影响细胞命运[23]。另外，敲除细胞极性调节物PARD6B 会造成CDX2表达减少，Nanog表达升高，并损害YAP 在外部细胞中的核定位。此外，抑制RHO-ROCK信号能激活Hippo信号并破坏细胞顶端极性，在抑制TE 同时增强ICM 特性[24]。进一步研究Hippo信号与细胞极性之间的联系是了解胚泡中细胞谱系产生的又一切入点。

随着分化进一步进行，ICM分化成内胚层与外胚层，外胚层经原条等多个步骤形成中胚层。研究发现，通过敲除YAP 可以促使Smad2/3 激活内源性Wnt3和细胞核β-catenin的表达，促进原条形成[25]。在PSC 向中胚层细胞分化过程中，Hippo通路转录效因子TAZ/YAP/TEAD，TGF-β通路中Smad2/3和多能性调节因子Oct4组成的调节复合物TSO 与转录阻遏蛋白NuRD 结合，促进多能性基因Oct4和Nanog表达，抑制中胚层基因FOXA2 及EOMES 等表达。近一步研究发现当FOXH1 与Smad2/3 结合后，TSO复合物被破坏，从而激活中胚层分化相关基因[26]。然而，YAP/TAZ 可与VGLL4 竞争性结合TEAD的SD 序列，从而促使该位点活化，但能否像FOXH1 一样破坏TSO复合物却是未知的。另一方面研究显示，YAP抑制转录因子P-TEFb 占有率和Ser7P-RNAPII 水平，导致染色质上Smad2/3 DNA复合物的激活受阻，从而抑制Smad2/3 对EOMES、MIXL1 等因子的激活。Wnt信号可稳定β-catenin 让其与pLEF-1/TCF DNA结合蛋白结合后进一步与中胚层相关基因的增强子结合，促进中胚层基因表达[27]。而YAP 敲除细胞中伴随着内源性Wnt信号增强与Activin/Smad2/3信号协同诱导分化。

由于缺乏外胚层祖细胞谱系特异性标记物及相关实验模型，阻碍了早期外胚层谱系调节机制的研究，使许多研究转向了外胚层来源的NSC。已经证明YAP 在NSC 中广泛表达，YAP表达下调可抑制视网膜祖细胞增殖并增加神经元细胞的产生，并且碱性螺旋-环-螺旋蛋白（basic helix-loophelix protein，bHLH）可抑制YAP活性，反过来YAP 可以拮抗bHLH 下游靶基因的表达，从而促进神经祖细胞增殖[28]，通过过表达bHLH 转录因子Ascl1 促进P19细胞神经元分化实验也得出了类似的结论。此外，过表达YAP 激活了Shh信号通路的下游靶基因Ptch1和转录因子Gli2的表达，从而抑制神经元分化[29]。在对神经胶质细胞研究中发现，BMP2通过与受体Neogenin 结合激活RhoA信号，促进YAP 与Smad1/5/8 相互作用，抑制NSC增殖并促进胶质细胞生成[30]。除化学信号外，基质弹性也可通过调节YAP活性影响神经元分化。研究证明，硬基质促进F-肌动蛋白聚合，导致YAP入核，促进NSC自我更新，软基质促进YAP的磷酸化，导致YAP 出核，促进神经元分化，在此过程中，当F-肌动蛋白的聚合被阻断，AMOT 可通过与YAP 结合将其隔离在胞核外，从而促进神经元分化[31]。另一方面，蛋白酶体抑制作用会增加YAP和AMOT 在胞质中的共定位，促进神经元分化，但其具体调节机制尚不完全清楚[32]。

间充质干细胞（mesenchyma stem cell，MSC）作为中胚层来源的一种SC，具有向成骨、软骨和脂肪细胞分化的能力。Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）调节成骨细胞形成，PPARγ调节脂肪形成的作用已经得到广泛证明。基于此，进一步研究发现YAP/TAZ与PPARγ相互结合抑制3T3-L1细胞中脂肪形成的同时增强Runx2转录活性，促进成骨细胞分化，并发现Wnt3a通过促进TAZ与PP1A、Runx2之间的相互作用影响分化，而YAP通过与β-catenin 结合阻止成骨，并诱导Wnt 拮抗剂Dkk1的表达，因此推测TAZ 在促成骨细胞分化中起主要作用[33]。另外，通过抑制LATS1/2表达，可促进体外MSC向成骨细胞和脂肪细胞转化[34]，与之前Yang 等[35]关于MSC中Hippo信号的激活促进脂肪细胞分化的结果相矛盾，这可能与细胞类型、培养条件不同有关。FGF2 激活ERK信号可增强TAZ与Runx2的相互作用促进成骨细胞分化，Phorbaketal A作为一种存在于海洋中的天然物，可通过诱导TAZ表达，促进TAZ与Runx2 相互作用的同时刺激ERK信号表达促进成骨细胞分化[36]，但FGF2 与phorbaketal A在TAZ 介导的成骨细胞分化过程是否具有相似机制需进一步探究。在软骨细胞形成中YAP 成下调趋势，LAST1/2和MST1/2 等的表达和活性随着软骨形成而逐渐增加。研究发现，一方面，在MSC 中过表达YAP可抑制Smad信号，导致BMP 靶基因Id1、Id2和Id3的降低，造成软骨细胞形成受抑制[37]，另一方面，在ATDC5细胞系中过表达YAP抑制软骨细胞的分化，部分原因是由于Wnt/β-catenin信号通路在其中发挥作用[38]。进一步研究显示，YAP通过与转录因子TEAD 结合调节Sox6表达在促进早期软骨细胞增殖的同时抑制Runx2诱导的人X型胶原α1链表达抑制软骨细胞成熟[39]。因此，TAZ 在调节软骨细胞生成中与YAP作用不同。基于以上成果，详细探究YAP和TAZ 在参与特定细胞分化过程中的联系与区别是有意义的。

哺乳动物心脏大部分是由胚胎中胚层经过一系列复杂过程分化而来的，通过多能心脏祖细胞分化为心肌细胞（cardiomyocyte，CM）并控制已经分化的CM 局部增殖来促使心脏形成，Hippo-YAP/TAZ信号通路被证明是心脏发育过程中CM增殖的主要调节因子。研究发现，YAP 在出生前非常活跃，出生后Hippo信号的激活会导致CM增殖受阻[40]，新生小鼠高水平的聚集蛋白（Agrin）与肌膜相关蛋白复合物（myomembrane associated protein complex，DGC）的结合阻碍Agrin 与YAP 结合，使YAP 出核，防止CM 过度增殖。出生7 d后，Agrin 水平降低导致YAP 与DGC 结合增加，从而阻止YAP 核移位，达到调整不同时期CM 生长的目的。另一方面，活性氧（reactive oxygen species，ROS）可激活Hippo信号，抑制细胞周期调节因子Cyclin/CDKs表达，因此对ROS的清除可延长出生后CM增殖时间，YAP 也可通过激活IGF信号和稳定β-catenin活性来促进CM增殖[41]。此外，通过体外将iPSC 经由中胚层细胞分化为CM的过程中发现YAP 与TEAD 相互作用抑制CM分化[42]。

YAP/TAZ 除了调节心脏生长外，在血管发育中也有一定作用。平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）作为血管中膜组成细胞，在维持血管结构和功能稳定方面发挥重要作用，研究表明TGF-β信号在SMC表型转换及分化中起关键作用。大部分证据显示TAZ通过非经典TGF-β信号通路促进SMC分化，TAZ通过促使细胞核中血清反应因子（serum response factor，SRF）和心肌素（myocardin，MYOCD）结合，激活平滑肌α 肌动蛋白（smooth muscle aorta，α-SMA）等SMC相关基因表达[43]。并且转录因子TEAD1通过诱导MYOCD和PITX2c的表达，促进SMC分化[44]。与此研究相反，在体外将ESC分化为SMC 过程中发现YAP 可阻断NK型同源盒基因转录因子2.5（NK2 transcription factor related，locus 5，NKX2.5）与MYOCD 启动子的结合抑制SMC分化[45]。NKX2.5是心脏发育过程中重要的转录因子，因此，进一步研究YAP/TAZ与NKX2.5 之间的关系将对心脏及血管发育机制有更深入的了解。

除以上研究外，Hippo-YAP/TAZ信号通路也影响其他ASC 向特定类型细胞的转化。大量研究表明，YAP/TAZ通过转录因子TEAD 与CYR61、CTGF 结合，与EGFR 配体结合及与Notch信号通路关联，在皮肤、胰腺、肝胆管和胃肠道等祖细胞干性维持及增殖方面有积极作用，并且在病理状态下介导各种成体细胞重编程为相应祖细胞。与癌细胞增殖过程类似，YAP/TAZ通过活化Wnt/β-catenin信号通路中转录因子TCF和LEF表达，激活下游靶基因的转录维持ASC多能性，抑制分化，此外，YAP/TAZ 也通过细胞外基质和细胞骨架蛋白影响组织力学以维持ASC 干性基因的表达。在上皮祖细胞增殖与分化过程中，MST1/2 缺失引起YAP活性增强，除了激活Fgf10和β-catenin信号，抑制Sox9的表达及与TGF-β信号发挥协同作用促进Sox2 转录外，也抑制Ajuba蛋白表达，促进上皮祖细胞增殖并抑制肺或气道上皮细胞的形成[46]。LATS1/2 及Fat4通过抑制核YAP/TAZ的含量或活性影响Wnt9b/β-catenin的活性，拮抗肾祖细胞增殖的同时抑制其向成肌纤维细胞的转化促进肾单位及输尿管上皮细胞形成[47]。与以上研究相反，YAP/TAZ与转录因子TEAD 及Klf4 结合既促进肠干（祖）细胞的增殖，又促进杯状细胞生成。并且HNF4α和CDX2 在肠上皮形成过程通过与YAP 启动子/增强子结合，促进肠组织生成的同时通过某种未知途径抑制胃组织生成[48]。此外，LIX1通过提高YAP活性促进胃间充质祖细胞增殖，抑制其分化[49]。

三、Hippo-YAP/TAZ信号通路与器官再生

Hippo信号可以调节心脏、肝脏、肠道、皮肤、肌肉、肺和神经等多种组织损伤修复和再生，本文仅对心脏、肝脏、肠道及皮肤的再生做一概述。在心脏再生过程中，YAP 在激活细胞增殖，细胞骨架重塑相关基因的表达及促进心外膜细胞产生的同时激活IGF-1和Akt信号以减少心肌细胞凋亡，使损伤心脏得到修复[50]。此外，YAP通过与转录因子FoxO1、Pitx2 结合，诱导抗氧化基因的表达，以此来应对不同原因造成的心脏损伤[51]。

Hippo信号在肝再生早期受到抑制，导致YAP活性增加，当肝再生终止后，MST1/2、LATS1/2和非磷酸化YAP 恢复到正常水平。在肝损伤和炎症发生过程中，YAP被暂时激活导致靶基因CYR61和AmotL2 转录水平增加，促进祖细胞增殖并抑制肝细胞分化[52]，此外，YAP 缺失使肝脏星状细胞增殖受抑制，导致巨噬细胞对坏死细胞的清除能力下降造成坏死性肝细胞大量产生。

在通过DSS/γ 射线照射处理后造成的肠损伤模型中发现，IL-6家族细胞因子共用受体gp130 可通过激活YAP表达，使肠隐窝细胞增殖速度加快并促进肠SC 标志基因Olfm4的表达[53]，并且在肠道损伤时，YAP通过瞬时激活抑制Wnt信号表达促使ASC重编程为肠SC，从而阻止肠SC分化为潘氏细胞，并激活EGFR信号通路来启动肠道再生程序[54]。

皮肤作为人体最大的器官，通过基底膜分为表皮层及真皮层。YAP 在早期胚胎表皮祖细胞中高度表达，YAP 缺失导致胚胎早期表皮组织形成不足。在皮肤损伤时，磷酸化YAP的存在导致角质层细胞分化受抑制造成伤口愈合延迟，此外，YAP通过诱导整合素调控的Src和EGFR-PI3K信号的表达，在促使皮肤损伤时基底层SC增殖的同时加速基底层细胞的分化使新生细胞得以不断产生[55]。当急性糖尿病造成皮肤损伤时，通过皮下注射神经肽P 物质可以促使YAP 核定位增加，使真皮层中内皮祖细胞增多促进伤口愈合。

四、总结

许多研究报道了Hippo-YAP/TAZ信号通路在SC 及再生医学中的重要作用，包括对于Hippo信号在体内胚胎发育过程中的重要性研究，应用重编程技术在体外诱导产生iPSC过程中YAP/TAZ作用的探究及细胞分化过程中Hippo信号和效应因子YAP/TAZ通过与TGF-β和Wnt 等通路的相互作用，器官损伤修复过程中YAP/TAZ 对组织再生的调节作用。然而，在SC分化及iPSC重编程过程中，上游信号分子如何精细调节Hippo信号及影响YAP/TAZ细胞定位等的确切机制需进一步探究。细胞通过何种方式产生、接受和传导Hippo信号及细胞外基质、机械信号具体是如何通过Hippo-YAP/TAZ信号通路影响SC增殖、存活、多能性及细胞谱系分化都是今后研究的方向。此外，对于YAP和TAZ 在SC分化过程发挥协同/拮抗作用调节组织器官发育平衡的机制尚不完全清楚。迄今为止，在体外将SC分化成不同组织细胞及类器官模型的研究为利用SC治疗疾病开辟了光明前景，因此研究Hippo-YAP/TAZ信号通路在体外细胞分化及类器官形成过程中的作用变得尤为重要。总之，根据已有的研究，未来对于Hippo-YAP/TAZ信号通路与SC相关联的研究会更加深入和广泛。