基于初级代谢产物的变化探究单面针与两面针的质量差异

邓 静，林秀莲，刘瑞莹，林丽美，廖端芳，吴 萍，夏伯候

湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室 湖南中医药大学，长沙 410208

单面针为芸香科花椒属植物蚌壳花椒(ZanthoxylumechinocarpumHemsl)的根、根皮、茎和叶，又名山枇杷、山椒根、黄椒根等，常用于脾运不健、跌打损伤、骨折等症[1]。两面针为芸香科花椒属藤本植物两面针(Z.nitidum(Roxb.)DC)的干燥根，别名入地金牛、双面针等，常用于治疗牙痛、神经痛、胃痛、咽喉肿痛、风湿性关节痛、毒蛇咬伤等多种病症[2,3]。二者多分布于云南、广东、广西等地，生长于山地林中，且均为木质藤本植物，外观上茎、枝、叶虽极为相似，但皮刺生长形状与部位却有区别。单面针叶片背面中肋上生小而下曲的锐刺，叶片正面无锐刺；两面针的幼枝，叶轴背面和小叶两面中脉上都有钩状皮刺[4]。通常可以依靠皮刺生长部位不同而从宏观上鉴定与区别这两类植物。近年来随着两面针药用和经济价值不断增加，导致市场中常用廉价单面针制成饮片冒充两面针，因此，有必要对两者的化学成分的差异性做进一步研究，从初级代谢产物出发，探寻两者有效成分及质量的差异。

据文献报道，两面针中的主要生物活性成分包括氯化两面针碱、氧化两面针碱、两面针碱、白屈菜红碱、鹅掌楸碱、德卡林碱、氧化刺椒碱等30多种生物碱[5]。此外还有橙皮苷、香叶木苷等黄酮类化合物，以及L-芝麻脂素，L-细辛脂素等木脂素类化合物[6]。单面针中的主要生物活性成分包括白鲜碱，花椒碱，茵宇碱，合帕洛平，胡萝卜苷，5，8-二甲氧基-3，4环氧呋喃香豆素，新橙皮苷，熊果酸等[7]。目前国内外关于单面针与两面针两者差异性研究的报道较少，Yang等[8]采用HPLC-Q-TOF/MS法对两面针和单面针中的生物碱进行分析，根据生物碱质谱裂解规律，从两面针和单面针的甲醇提取物中鉴定了32种生物碱。而目前大部分研究集中于单面针与两面针次级代谢产物的差异，无其初级代谢产物差异的相关研究。植物在长期的进化过程中，产生了数量庞大、结构迥异的初级代谢物，这些代谢物在植物生长形态、适应环境以及药物功效等方面发挥着重要的作用，因此有必要探寻两种药用植物间初级代谢产物的差异。

代谢物作为生物体表型的基础，其能够直观有效地解释植物生命现象并揭示表型内在可能的本质。代谢组学本质上是指从整体上研究生物体的代谢物，是对某一生物、组织或细胞中的所有低分子量代谢产物进行定性与定量分析的一门科学。而植物代谢组学以指标分析为基础，高通量检测为手段，通过分析植物组织中的代谢物，从整体上定性、定量测定不同表型对代谢物的影响，从而解析代谢物的代谢合成途径、代谢物网络及调控机制[9]，由代谢合成途径与代谢网络的差异可进一步推导出植物表型差异的内在机制。代谢组学相对于基因组学、转录组学以及蛋白质组学而言，更关注生物体的表型，是目前被认为最接近表型的组学[10]，可通过应用于表征代谢产物整体变化的靶向或者非靶向性方法，来揭示植物表型差异的原因，因此，代谢组学目前是植物表型差异潜在生物标志物筛选中最有前景的发展方向。

综上所述，本研究拟以单面针与两面针为研究对象，通过溶剂提取法，建立其GC-MS代谢产物的分析方法，并通过相似度评价法、主成分分析(principal components analysis，PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等化学计量学方法分析两者初级代谢物的差异，筛选其内在差异标志物，并通过MetaboAnalyst、KEGG等工具及数据库富集其代谢通路，研究其代谢机制，探寻代谢网络内在联系与其质量的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

单面针和两面针样品均由株洲千金药业股份有限公司提供，经湖南中医药大学中药鉴定学教研室龚力民副教授分别鉴定为芸香科花椒属单面针Z.echinocarpumHemsl与芸香科两面针Z.nitidum(Roxb.)DC.的根。

1.2 仪器与试剂

岛津GC-MS QP2010气相色谱质谱联用仪(岛津公司)，HP-5石英毛细管柱，CP114型电子天平(奥豪斯上海有限公司)，-20 ℃冰箱(Haier)，高速离心机(德国Eppendorf)，精密移液枪(德国Eppendorf)。

吡啶(Sigma-Aldrich试剂公司)，双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，Sigma-Aldrich试剂公司)，甲氧胺盐酸盐(纯度98%，Sigma-Aldrich试剂公司)，甲醇(国药化学试剂有限公司)。

1.3 样品前处理方法

参照Quéro等[11]的样品前处理方法，根据实验具体情况做些许改变，具体方法如下：

精密称取样品100 mg，加入1 400 μL甲醇(-20 ℃)，涡旋1 min，在70 ℃下水浴加热30 min，待充分冷却后，补重，离心5 min(13 000 rpm)，取上清液400 μL，加入50 μL核糖醇-甲醇溶液(1 mg/mL)为内标，涡旋1 min。在N2下吹干，加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，在水浴温度30 ℃下肟化1 h，加入100 μL BSTFA，在水浴温度45 ℃下反应2 h，进行硅烷化反应。衍生后溶液转入进样瓶(加内衬)，气相色谱质谱联用仪进行分析。

质量控制样本(QC样本)：从每份样品中称量等量单面针(两面针)粉末，将称取的粉末混合成一个混合样本，用作QC样本。将QC样本均匀的插入到分析序列中，以考察整个分析过程的重复性。

1.4 GC-MS条件

HP-5石英毛细管柱；进样口温度270 ℃；载气为He；体积流量1 mL/min；进样量1 μL；分流比25∶1；电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度270 ℃；溶剂延迟5 min；TIC模式质量范围m/z35～550。

GC升温程序:70 ℃，保持2 min；70～85 ℃，10 ℃/min；185 ℃，保持3 min；185 ～210 ℃，3 ℃/min；210 ℃，保持2 min；210～270 ℃，15 ℃/min；270 ℃，保持10 min。

1.5 代谢物鉴定

利用AMDIS自动质谱图卷积识别软件结合美国国家标准与技术研究院(NIST)化学数据库，将GC-MS检测出的主要代谢物成分与在线EI-MS数据库(oliver fiehn lab)和相关文献报道的化合物进行匹配，鉴定相似度大于85%且满足80%的通用性原则，RSD小于30%(QC)的代谢物。最后以核糖醇(内标)的峰面积为标准归一化所有物质的峰面积。

1.6 数据分析

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到单面针和两面针GC-MS指纹图谱，并做相似度评价；所有均做Pareto scaling处理，利用多元变量统计分析软件(SIMCA)进行主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)筛选出差异性代谢物。为进一步明确单面针和两面针药材的差异，本研究以相对峰面积作为指标分析差异性成分在单面针和两面针中的相对含量。最后，通过MetaboAnalyst4.0(http://www.metaboanalyst.ca/)、KEGG(https://www.kegg.jp/)等工具及代谢数据库的路径分析以及查阅文献，分析筛选后得到代谢途径，并构建代谢网络。

2 结果与讨论

2.1 建立代谢物指纹图谱及相似度分析

分别取单面针、两面针的供试品溶液按“1.3”项下条件进样测定，得到其代谢物指纹图谱如图1所示。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，分析得到其相似度热点图，由图2可知，被测同种植物组内初级代谢产物相似度高(r>0.8)，而组间(非同种植物)的相似度较低(0.5

图2 单面针(S组)和两面针(L组)的相似度比较

图1 单面针和两面针GC-MS图谱

2.2 代谢物GC-MS数据鉴定

利用NIST以及在线数据库并结合相关文献，将这些通过GC-MS检测出的代谢物的保留时间、精确分子量及碎片离子与化合物进行匹配，最终鉴定出49个相似度在85%以上的代谢物。这些代谢物的相对含量见图3，结果可得两面针中大部分的初级代谢物的含量均高于单面针，这些鉴定出来的代谢产物可以分为有机酸类、糖类、氨基酸类、多元醇、脂肪酸、胺、糖苷和其他物质，分别占总代谢物的31%、27%、12%、12%、10%、4%、2%和2%。

图3 代谢物的鉴定以及相对含量图

2.3 潜在差异性代谢物的验证

首先，本研究利用无监督的PCA方法得到所有数据样本的得分图4。从图中可看出，QC样本在中心紧密聚集，随着时间的推移显示出最小的漂移，说明了本研究建立的GC-MS方法所得数据具有可靠性，组间的分离是由于真实的生物变异性而不是分析方差造成的，可进行接下来的数据处理。在单面针与两面针的PCA图中，代谢物均分布在95%的置信区间内，没有异常样本值，但有个别数据存在部分的交叉，所以为了突出组间差异，便于后续寻找差异成分，本研究进一步利用有监督的OPLS-DA方法来进行分析(图4)，从图中可看出单面针、两面针各自聚为一类，表明单面针和两面针代谢物成分的差异较显著。对模型进一步利用置换检测，发现模型R2Y与Q2分别达到0.981和0.855，说明模型较优、无显著过拟合现象。利用相应S-plot图(图5)寻找二者之间的差异[12]，筛选P<0.05，P(corr)>0.5以及VIP得分图中VIP>1(图6)的变量，根据HMDB和KEGG等数据库以及文献中数据对差异物进行比对，从中筛选出5个差异性代谢物，分别为quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose。

图6 VIP评分图

图5 S-plot图

图4 PCA和OPLS-DA的得分图

2.4 标记代谢物的相关与差异分析

同时，为进一步探寻各差异性代谢物之间的关系，本研究以各代谢物的相对含量为对象，通过以各个代谢物之间的相关系数为指标，得到其相关系数热点图(图7)。在相关值大于0.50的阈值(r值> 0.5)时，有超过20对代谢物呈现正相关关系，超过10对代谢物呈负相关关系，其中quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose之间均具有较高的相关系数，说明筛选得到的差异性代谢物之间相互关联且共同作用，未来对这些代谢物作用的详细研究将有助于阐明这些代谢物中的关键代谢网络。

图7 代谢物相关系数热点图

为明确上述成分在单面针和两面针药材中的含量差异，本研究以差异性代谢物的相对含量作为指标进行比较，从图8中可以直观地看出，两面针中quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose的相对含量均显著高于单面针，结合KEGG等数据库进行分析，结果发现(表1)这些代谢物与苯丙氨酸途径，果糖和甘露糖代谢，糖酵解以及淀粉与蔗糖代谢相关[13]。

表1 标志代谢物相关通路

图8 差异性代谢物的相对含量比较盒型图

2.5 代谢通路富集分析

对代谢物的相对含量进行富集分析，结果如图9所示，圆圈的大小呈现出通路的富集倍数，圆圈体积越大，表示通路的富集程度和重要性越大，虚线代表各个通路之间的相互作用关系。由结果可知，氨基酸和糖类相关的代谢通路变化显著，共分析得到4条代谢通路：包括苯丙氨酸等氨基酸的代谢和糖酵解、氨基糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等糖类代谢相关通路。

图9 代谢物富集分析及相关代谢物通路图

奎宁酸是一种芳香族氨基酸生物合成的前体物质，植物体内的苯丙氨酸解氨酶(PAL)可促进奎宁酸的合成，PAL是连接初级代谢和苯丙烷类代谢第一步反应的关键酶与限速酶[14]，而黄酮类化合物的生物合成都是通过苯丙烷类生物途径，因奎宁酸在两面针中含量高于单面针，故而在单面针与两面针的次级代谢产物中，黄酮类化合物如橙皮苷、牡荆素等含量在两面针中较为丰富[15]。苯丙氨酸代谢途径是植物次级代谢中很重要的一条通路，在PLA作用下苯丙氨酸被催化生成香豆酸、咖啡酸、芥子酸等中间产物，再在4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)催化下生成苯丙烷酸CoA酯，进一步转化为苯丙素类化合物。这些次生代谢产物对植物生长发育、抵御病虫害、构成植物支撑系统等方面具有重要意义。同时，两面针作为广泛应用于临床的中药材，其生物碱类、木质素类、黄酮类等化合物为其主要药效物质[16]，苯并菲啶类生物碱药理活性最为显著，具有较强的抗肿瘤活性[17]，总生物碱有明显的抗急性脑缺血作用、抗炎抗溃疡作用[18]、抑制乙酰胆碱酶活性、抗病毒作用[19]，木质素化合物具有较显著的镇痛作用，故此途径对控制药材质量及衡量药用价值有一定参考意义。相比于单面针，两面针的差异代谢物的含量均较高，且苯丙氨酸代谢途径更为活跃，故药效物质积累更为丰富，提示这是两者产生差异的原因。

此外，其他的差异性通路与糖代谢具有显著相关，而糖代谢的调节与植物激素组成复杂的信号网络体系对植物生长发育和基因表达起重要调控作用，进而对植物表型产生一定影响。糖的代谢是整个生物代谢的中心，它联通了脂类代谢、核酸代谢、蛋白质代谢及次生物质代谢[20]。糖类的合成与分解影响细胞及溶液的渗透势，而氧份运输的动力和水分的流动均取决于渗透势的变化，从而影响植物气孔开闭、花药裂开等活动[21]。同时，糖代谢引起的渗透势还起到调节植物抗胁迫环境的能力，从而导致植物的表型出现宏观上的差异。糖类的代谢及运输分配还会影响进入细胞的糖及贮存的糖的形式，从而对植物的品质、中药材的有效成分含量均会产生影响，通过运用代谢物通路的富集技术找到关键性代谢通路，可以对单面针和两面针进行质量控制和品质评价。

3 结论

本研究采用基于GC-MS的代谢组学技术，筛选出5个差异性代谢物，通过研究它们在单面针和两面针中的相对含量，发现两面针中quininic acid、D-talose、glycerol、D-glucose以及D-fructose的相对含量均显著高于单面针。利用KEGG等数据库对这些差异性代谢物进行特异性鉴定，发现这些物质是主要代谢途径的关键中间体，参与苯丙氨酸途径，果糖和甘露糖代谢[22]，糖酵解以及淀粉与蔗糖代谢[23]等多种代谢途径。提示代谢组学结合化学计量学分析方法可作为区分单面针与两面针特征性成分的有效方法，该分析结果对深入研究单面针与两面针质量差异的机理具有一定的参考价值，今后可作为通过代谢工程提高质量的基础，对于单面针和两面针的质量控制、农业种植以及品质提升具有重要的意义。