鸟嘌呤核苷酸抑制因子2基因表达与肝癌细胞迁移和侵袭能力的关系*

王雅冰 赵孟杰 孙景武 石林昌

河北中石油中心医院肝胆外科 (河北 廊坊，065000)

目前临床上治疗肝癌的有效方法主要是手术及肝移植，但即使手术成功，患者仍需要长时间恢复[1]。鸟嘌呤核苷酸抑制因子2(RhoGDI2)是小G蛋白调节因子家族成员之一[2]，是一种肿瘤转移相关因子[3]。有研究报道RhoGDI2在胃癌、肺癌及乳腺癌细胞中的表达水平并不一致，但关于RhoGDI2在肝癌组织中的表达情况及其作用并无相关报道。本文在相关文献报道的基础上[4]，进一步研究RhoGDI2基因在肝癌细胞中表达水平是否受miRNAs的调控；通过一系列实验下调RhoGDI2表达，研究相关表达对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞 选取高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3细胞，随机分为对照组、空白转染组、shRNA转染组，其中空白转染组转染空白质粒，shRNA转染组转染RhoGDI2-shRNA。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染 肝癌细胞培养：肝癌HCCLM3细胞在含10%胎牛血清DMEM完全培养基、5% CO2饱和湿度、37℃培养箱内常规传代培养。腺病毒感染：按每细胞5病毒感染，HCCLM3细胞铺6孔板，待底面积上细胞长至80%时，用AdNDRG2或AdLacZ处理48 h(病毒感染量为5 MOI)。siRNA转染：HCCLM3细胞铺6孔板，待底面积上细胞长至80%时，运用脂质体法转染siRNA-NDRG2或siRNA-NC作用细胞48 h。

1.2.2 细胞侵袭、迁移试验 将腺病毒或siRNA作用48 h后的肝癌细胞种于使用Matrigel胶预处理的24孔Transwell上层小室，加入无血清培养液500 μl，加含10%胎牛血清的培养液于下层小室中。24 h后将培养液倒出，乙醇固定Transwell 15 min后龙胆紫染色10 min,最后用棉签去除上层小室底壁上的细胞，光镜下计数通过Matrigel胶侵袭到下层中的细胞数。重复以上实验3次。

1.2.3 Western Blot检测[5]将对照组和处理组的HCCLM3细胞用预冷的无菌PBS缓冲液清洗2遍，加细胞裂解液。用干净的细胞刮刀将贴壁细胞刮下，吹打，混匀，收集细胞裂解液于1.5 ml离心管中。95℃孵育5 min，立即在冰上冷却。超声8 s，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清蛋白提取液，-80℃保存并做好记录。采用BCA法进行蛋白定量测定，参照 BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行[6]。

1.2.4 qRT-PCR检测[7]提取细胞总RNA并将其反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行qPCR 。qPCR扩增体系设置为20 μl体系，cDNA模板不稀释，内参基因为GAPDH。观察扩增曲线及熔解曲线。从扩增曲线可以看出，4个复孔的荧光值曲线拟合良好，CT值接近，说明反应体系稳定，可重复性好，结果可靠。从熔解曲线可以看出，曲线为一个主峰，曲线顶峰温度稳定，说明扩增产物具有特异性。计算 2-△△CT，并进行统计学分析。

2 结果

2.1 各组细胞RhoGDI2 mRNA表达情况 shRNA转染组细胞RhoGDI2 mRNA相对表达量为(0.201±0.082)，明显低于对照组(0.760±0.130)和空白转染组(0.763±0.121)，差异有统计学意义(F=21.011，P<0.05)。

2.2 各组细胞增殖情况 shRNA转染组细胞培养6 h、12 h和24 h时OD值明显低于对照组和空白转染组(P<0.05)，见表1。

表1 各组细胞不同时间点OD值比较

2.3 各组细胞迁移能力比较 shRNA转染组细胞迁移率为(0.310±0.030)%，明显低于对照组(0.708±0.041)%和空白转染组(0.710±0.031)%,差异有统计学意义(F=9.182，P<0.05)。见彩插页图1。

2.4 各组细胞侵袭能力比较 shRNA转染组细胞穿膜细胞数为(9.28±1.11)个，明显低于对照组(42.01±13.10)个和空白转染组(44.92±12.90)个，差异有统计学意义(F=21.192，P<0.05)。见彩插页图2。

2.5 各组细胞MMP-9、pAKT和VEGF表达 shRNA转染组细胞MMP-9、pAKT和VEGF相对表达量明显低于对照组和空白转染组(P<0.05)，见表2、图3。

表2 各组细胞MMP-9、pAKT和VEGF表达比较

A：对照组 B：空白转染组 C：shRNA转染组

3 讨论

肝癌的致病因素各种各样，发病机制不明[8]，也缺乏判断其发病原因的有效指标。肝癌的早期诊断对肝癌治疗具有重要作用。随着肿瘤基因组学的发展，人们便对肿瘤的发展及机制有了更全面的认知，也为肿瘤的早期诊断和基因治疗提供了理论基础。已有研究发现，肝癌发生、发展的重要分子学机制是癌基因的异常表达和抑癌基因表达的明显减少甚至缺失[9]。现阶段肝癌的研究主要集中在识别与发现和肝癌发生发展有关的特异性基因，并以此为靶点寻找肝癌的早期诊断方法和有效治疗手段。肝癌发生的重要原因主要是正常肝细胞的恶性转化及凋亡调控功能的异常，因此对凋亡调控失调的相关研究可能找到治疗肿瘤的方法[10]。机体内外的多种因素均可能影响甚至改变细胞凋亡进程，对这些因素的干预可以在不同的节点上调控细胞凋亡的进程和数量。RhoGDI2基因在肿瘤的发生、发展和转归过程中发挥着重要的作用，已有研究证实了RhoGDI2基因与细胞的生长和分化相关，但在不同癌症组织中RhoGDI2 的作用并不相同，作用途径亦各有区别，还与肿瘤细胞的增殖及侵袭有极大的联系[11]。同时RhoGDI2在缺氧和应激反应中也有着重要作用，是树突状细胞抑制T淋巴细胞增殖所必需的共同刺激信号，也是醛固酮对肾远曲小管和集合管的水钠代谢调节的重要纽带[12]。

本研究结果显示，shRNA转染组细胞RhoGDI2 mRNA相对表达量、OD值、穿膜细胞数，MMP-9、pAKT和VEGF表达明显低于对照组和空白转染组，说明 RhoGDI2基因与肝癌的的发生、增殖及侵袭过程呈正相关，RhoGDI2会影响肿瘤侵袭转移，因此研究RhoGDI2基因将有助于加深对肝癌侵袭转移机制的了解，并为肝癌特异性和多靶位的治疗方法研究提供理论基础[13]。本研究在前期研究的基础上进一步从mRNA水平探索RhoGDI2对肝癌迁移和侵袭能力的影响，提示该基因可能参与了肝细胞肝癌的发生和发展，具有一定的创新性和临床指导意义。