手足口病病毒核酸及抗体检测的比较研究及应用*

赵 云，蔡晶娟△，彭 程，王紫荆，尹清金，孙照华，牟 杨，卢亚陵，蒋 燕，宋晓燕

(1.成都儿童专科医院，四川成都 610015；2.四川省广安市人民医院，四川广安 638001；3.成都市妇女儿童中心医院，四川成都 610091)

手足口病是一种由肠道病毒感染所引起的传染性疾病，其主要的病原体包括肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)，好发于5岁以下的儿童[1-2]。重症病例可并发中枢神经系统炎症、心肌炎、神经源性肺水肿等，患儿早期临床症状不典型、病情常急转直下，往往在发病早期突然出现预后不良的情况，并由此引发医患矛盾[3-4]。对手足口病患儿实施隔离可切断手足口病的传染源，是预防手足口病流行的重要措施，而患儿的排毒时间是制订隔离期的重要参考。极少数重症患儿皮疹不典型，临床诊断困难。因此，对手足口病患儿进行实验室早期诊断以及对EV71与CA16等肠道病毒的感染进行准确鉴别就显得非常重要[5-6]。本研究采用肠道病毒核酸检测联合血清学抗体检测方法，探讨该方法在手足口病诊断及防控中的临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年5月至2019年2月在成都儿童专科医院就诊的手足口病患儿，临床诊断均符合2018年国家卫生健康委员会制定的《手足口病诊疗指南(2018年版)》标准，使用RNA恒温扩增检测技术(SAT)对手足口病患儿进行EV71及CA16核酸检测，同时采用胶体金法(金标法)对患儿血清中的EV71、CA16特异性IgM抗体进行联合检测。将上述检测方法中任意一项出现阳性的患儿纳入研究。纳入290例手足口病患儿，其中男170例，女120例；年龄4个月至11岁，中位年龄2.9岁，<1岁患儿28例，1～5岁患儿225例，>5岁的患儿37例。排除标准:(1)家长不合作或失访的患儿;(2)初诊时病毒核酸及抗体标本检测均为阴性的患儿。本研究经成都儿童专科医院医学伦理委员会批准，入组患儿的监护人均已签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 实时荧光定量PCR仪由西安天隆科技有限公司生产，型号为TL988；试剂采用北京万泰生物药业股份有限公司生产的CA16和EV71 IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)。

1.3方法

1.3.1核酸检测方法 通过SAT，以病原体特异的16s rRNA为靶标，在M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶的作用下进行恒温扩增，产生的大量RNA与带有荧光标记的优化探针特异性结合，扩增信号和荧光信号的检测同步进行，从而实现了病原体的快速检测。

1.3.2血清学抗体检测方法 将采集的全血标本立即进行离心，取上清液，血清标本严格按照试剂盒说明书上的操作流程进行检测。

1.4观察指标 比较初诊及病程2周的复诊患儿CA16、EV71核酸和CA16、EV71抗体检测结果。

1.5统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行统计处理和分析。计数资料以百分率或例数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，等级资料比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两种检测方法在不同年龄初诊患儿中的检出率比较 初诊患儿中EV71核酸检测阳性17例(5.9%)，CA16核酸检测阳性81例(27.9%)，核酸检出率为33.8%(98例)；EV71血清学抗体检测阳性153例(52.8%)，CA16血清学抗体检测阳性183例(63.1%)，血清学抗体检出率为84.5%(245例，其中双抗体阳性91例)。两种检测方法检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两种方法联合检测阳性286例(98.6%)。<1岁初诊患儿核酸检测阳性5例，抗体检测阳性24例，两种检测方法检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；1～5岁初诊患儿两种检测方法检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；>5岁初诊患儿两种检测方法检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同年龄初诊患儿两种检测方法结果比较(n)

2.2两种检测方法在不同年龄复诊患儿中的检出率比较 复诊患儿中核酸检测阳性49例(16.9%)，其中EV71核酸检测阳性11例(3.8%)，CA16核酸检测阳性38例(13.1%)。抗体检测阳性240例(82.8%)，其中EV71血清学抗体检测阳性177例(61.0%)，CA16血清学抗体检测阳性207例(71.4%)。两种检测方法检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。<1岁复诊患儿核酸检测阳性2例(0.69%)，抗体检测阳性23例(7.93%)，两种检测方法检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；1～5岁复诊患儿两种检测方法检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；5岁以上复诊患儿两种检测方法检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同年龄复诊患儿两种检测方法结果比较(n)

2.3初诊与复诊患儿两种检测方法检出率的差异 初诊患儿的核酸检测阳性率为33.8%，复诊患儿的核酸检测阳性率为16.9%，不同病程时期核酸检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。初诊患儿的抗体检测阳性率为84.5%，复诊患儿的抗体检测阳性率为82.8%，不同病程时期血清学抗体检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3～4。

表3 初诊与复诊患儿的核酸检测结果比较(n)

表4 初诊与复诊患儿的血清学抗体检测结果比较(n)

3 讨 论

手足口病发病率为37/100 000～205/100 000，病死率也较高，且近年来其发病率有逐年增长的趋势。手足口病能通过粪口途径、呼吸道飞沫、接触途径传播[5-6]。引发手足口病的肠道病毒有20余种，以EV71和CA16最为常见，EV71感染更被认为是导致手足口病患儿死亡的最主要原因，其传染性较强，能在短时间内造成较大范围的流行[7-8]，严重威胁儿童的生命健康。

采用胶体金法进行血清学抗体检测，具有操作简便易行、标本可批量处理等优点，在临床上应用较为广泛，但其缺点在于检测过程中会因存在抗体交叉反应而出现较高的假阳性率，也可能受胶体金硝酸纤维素膜检测线上包被的抗原种类限制以及体内抗体滴度因素影响而出现假阴性。而SAT的优点为检测快速敏感，可早期诊断，并且可同时检测EV71、CA16和肠道病毒通用型，对手足口病肠道病毒病原体各种常见亚型实现全覆盖，是目前临床实验室的主要检测方法[9-10]。本研究对比两种检测方法的检出率，差异有统计学意义(P<0.05)，且病毒血清学抗体检出率显著高于肠道病毒核酸，二者吻合度和一致性不高。造成该现象的可能原因有以下3点：(1)患儿感染后血清抗体为非特异性的。(2)患儿感染其他亚型肠道病毒后，抗体在体内存在时间较长，会对结果造成影响。(3)胶体金法假阳性率较高。在进行血清学抗体检测时，两种病毒血清学抗体初诊检出情况为CA16阳性183例，EV71阳性153例，2周复诊时，CA16阳性207例,EV71阳性177例，复诊阳性数均高于初诊。一方面反映出抗体在体内持续时间长，另一方面也提示初、复诊均有部分标本出现了EV71-IgM和CA16-IgM双抗体阳性结果。这是由于EV71与CA16基因水平的同源性为77%，而氨基酸水平的同源性为86%[3,5]，因此笔者认为此类标本需要核实核酸检测结果，才能明确具体病原体，以及是否为合并感染。由于实验室检查的局限性和研究设计上的缺陷，本研究未对该类标本检测结果进行鉴别。两次检测结果提示，病毒血清学抗体在体内持续时间更长，提示病毒血清学抗体检测不利于判断疾病恢复期病毒复制情况，也不利于判断是否需要延长隔离时间。

考虑到不同病程、不同标本采集方法、病毒复制、排毒周期以及个体免疫差异等因素，单一的检测方法均存在一定的局限性和漏检情况。因此，在患儿患病早期或者免疫功能比较低下时，采用核酸与抗体联合检测的方式有助于提高早期检出率[7,11]，最终实现预防感染和控制疾病流行的目的，为患儿的后续治疗提供可靠依据。

重症患儿症状缓解出院后或多数患儿在起病2周后，临床症状已经消失，但仍有部分患儿存在排毒的情况，提示有症状的患儿和无症状的康复期患儿均可能成为传染源[12-14]，导致所在社区、学校的手足口病传播与流行。因此，明确手足口病患儿的排毒时间，对防治手足口病具有重要意义。由于核酸检测可以更加准确地判断疾病恢复情况，因此建议在恢复期进行病毒的核酸检测，有助于该病的防控工作。

4 结 论

EV71与CA16核酸与抗体检测结果的一致性不高。抗体检测存在交叉反应阳性。核酸检测有助于了解患儿恢复期病毒复制情况，对确定手足口病患儿在病程2周后是否仍需要延长隔离时间以及准确制订隔离期具有较大意义。核酸与抗体联合检测可一定程度上避免单一方法检测的局限性，有助于提高早期检出率，为患儿的后续治疗提供可靠依据。