食管癌组织中TROP2的表达水平及临床意义

庹晓霞

(四川省广元市妇幼保健院检验科，四川广元 628000)

食管癌是发生于食管上皮的消化道恶性肿瘤，具有一定的地域分布差异，我国是食管癌发病率及病死率较高的国家之一，死亡患者占全部恶性肿瘤死亡患者的1/4，严重威胁患者生命健康[1]。目前外科手术切除仍为食管癌治疗的首选方案，但因早期食管癌无明显特异性表现，多数患者就诊时已属中晚期，术后预后较差。因此，早期诊断并评估疾病进展趋势是改善食管癌患者预后的有效途径。近年来随着分子生物学技术的发展，相关基因的表达也逐渐被用于恶性肿瘤的诊断及预后评估中，为疾病的防治提供了一定参考。人滋养层细胞表面抗原-2(TROP2)是一种跨膜表面糖蛋白，因在人滋养层细胞表达量较高而得名，其表达量高也被认为是胎盘具有较强侵袭力的重要原因[2-3]。近年的研究证实，TROP2的表达也与人类恶性肿瘤相关，其在多种实体肿瘤中均存在高表达，与肿瘤侵袭、转移及预后有密切联系[4-5]。目前TROP2的表达与食管癌的关系研究较缺乏，本研究对食管癌组织中TROP2及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)基因mRNA表达情况进行检测，分析其相关性，并对TROP2蛋白表达情况进行检测，分析其与临床指标及预后的关系，旨在为临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2009年7月至2018年9月于本院行外科手术的85例食管癌患者作为研究对象，以手术切除的食管癌组织作为研究标本。食管癌患者纳入标准：初治患者；经病理学诊断为食管癌；临床资料完整。排除标准：行外科手术前进行放疗、化疗及其他疗法者；合并心脑血管疾病者；合并自身免疫性疾病者。85例食管癌患者中男59例，女26例；年龄35～70岁，中位年龄53岁；鳞癌75例，腺癌10例；部位：胸上段3例，胸中段49例，胸下段33例；分化程度：高分化6例，中分化47例，低分化32例；肿瘤浸润深度：黏膜及黏膜下层6例，肌层30例，外膜49例；病理分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期48例，Ⅲ期18例；淋巴结转移者20例，未转移者65例。另从这85例食管癌患者中选择50例距食管病变边缘5 cm以上的癌旁组织作为对照，所有对照标本组织均经病理科证实无异常改变。

1.2方法

1.2.1标本采集及保存 食管癌组织取手术后病灶中心组织，癌旁组织取距食管病变边缘5 cm以上的正常组织。所有标本取得后立即置于液氮中保存。

1.2.2RT-PCR检测mRNA表达 (1)总RNA提取及反转录：采用Trizol法进行组织标本RNA提取，采用StarScriptⅡ First-strand cDNA Synthesis Mix试剂盒进行反转录，获取cDNA进行水平检测。(2)RT-PCR：引物序列，TROP2(正向5′-TAC GAG CAG CCC ACC ATC C-3′，反向5′-TCG GTT CCT TTC TCA ACT CCC-3′)；MMP-9(正向5′-GCG GAT CCA GCG CCC AGA GAC AC-3′，反向5′-TGG ACG ATG CCT GCA ACG TG-3′)；E-cadherin(正向5′-CGA CCC AAC CCA AGA ATC TA-3′，反向5′-AAT GGC AGG AAT TTG CAA TC-3′)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，正向5′-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC A-3′，反向5′-GAT AGC ACA GCC TGG ATA GCA A-3′)。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。(3)结果观察及统计：采用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳，以各基因mRNA表达与GAPDH条带亮度比值作为表达量。

1.2.3免疫组织化学法检测TROP2蛋白表达 (1)免疫组织化学染色：组织标本采用多聚甲醛固定，石蜡包埋并切取4 μm的石蜡切片。石蜡切片脱蜡后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，采用3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，过氧化物酶灭活后PBS冲洗3次。加入5%的牛血清清蛋白，37 ℃孵育10 min。滴加羊抗人TROP2多克隆抗体(1∶100，英国Abcam公司)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗。加入即用型羊抗兔鼠二抗(英国Abcam公司)37 ℃孵育30 min，PBS冲洗。加入S-P溶液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，采用二氨基联苯胺显色，镜检显色满意后可终止显色，经复染、脱水、透明、封片等操作完成制片。(2)结果判定：免疫组织化学切片镜检，根据染色细胞数占总数的百分比进行染色范围计分，其中无染色为0分；不足10%为1分；10%～50%为2分；>50%～80%为3分；>80%为4分。根据染色细胞的染色深浅进行染色强度计分，其中无着色为0分；黄色(+)为1分；浅棕色(++)为2分；棕褐色(+++)为3分。根据染色强度及范围的积分(乘积)评价阳性表达情况：积分0～3分为阴性表达(-)；积分>3～6分为弱阳性表达(+)；积分>6～9分为阳性表达(++)；积分>9～12分为强阳性表达(+++)；以积分≥4分判定为阳性表达。

2 结 果

2.1TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA在食管癌组织中的表达情况 RT-PCR结果显示，癌旁组织中TROP2、MMP-9基因mRNA的相对表达量明显低于食管癌组织，E-cadherin基因mRNA的相对表达量明显高于食管癌组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析提示，TROP2基因mRNA表达量与MMP-9基因mRNA表达量呈正相关(r=0.326，P<0.05)，与E-cadherin基因mRNA表达量呈负相关(r=-0.307，P<0.05)。见图1。

注：A为电泳结果；B为TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA相对表达量检测结果；与癌旁组织比较，*P<0.05。图1 TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA在食管癌组织中的表达情况

2.2TROP2蛋白在食管癌组织中的表达情况 免疫组织化学结果显示，TROP2蛋白在食管癌癌旁组织中未见或少量表达，免疫组织化学染色积分0～6分，平均(4.15±1.07)分，阳性表达率为14.00%(7/50)；TROP2蛋白在食管癌中主要表达于肿瘤细胞的细胞膜及细胞质内，细胞核不着色，免疫组织化学染色积分0～12分，平均(6.98±2.71)分，阳性表达率为42.35%(36/85)。食管癌组织TROP2蛋白免疫组织化学染色积分显著高于癌旁组织，阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)。部分食管癌组织TROP2蛋白表达情况见图2。

注：A为阴性表达；B为阳性表达。图2 食管癌组织中TROP2蛋白表达情况(×200)

2.3TROP2蛋白表达与食管癌临床资料的关系 肿瘤分化程度、浸润深度、病理分期、淋巴结转移与食管癌患者TROP2蛋白表达相关(P<0.05)。见表1。

表1 TROP2蛋白表达与食管癌临床资料的关系[n(%)]

2.4TROP2蛋白表达的影响因素分析 多因素Logistic回归分析提示，肿瘤浸润深度、病理分期与TROP2蛋白表达相关(P<0.05)。见表2。

表2 TROP2蛋白表达阳性的影响因素分析

2.5不同TROP2蛋白表达的食管癌患者生存曲线分析 85例患者均进行随访，随访截止日期为2019年3月，随访时间为5～90个月。Log-rank检验显示，TROP2蛋白阳性表达组生存率明显低于阴性表达组(χ2=8.623，P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线见图3。

图3 不同TROP2蛋白表达的食管癌患者Kaplan-Meier生存曲线

2.6影响食管癌预后的COX多因素分析 COX多因素分析提示，食管癌患者肿瘤浸润深度、分化程度、病理分期及TROP2蛋白表达是预后不良的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响食管癌预后的COX多因素分析

3 讨 论

TROP2基因所编码的产物为含323个氨基酸的蛋白质，是一种肿瘤相关抗原，在角膜、胰腺等诸多器官中均有表达，其在多层上皮细胞、滋养层细胞表达量较高[6]。近年来的研究证实，TROP2基因在大肠癌、肺癌、乳腺癌等诸多实体瘤中均存在高表达，且可能与肿瘤的侵袭性相关，可作为部分肿瘤基因治疗的靶点[7]。

本研究从转录水平分析食管癌患者TROP2基因及其下游MMP-9、E-cadherin基因表达情况，结果显示食管癌组织中存在TROP2、MMP-9高表达及E-cadherin低表达。既往研究表明，TROP2、MMP-9高表达及E-cadherin低表达是细胞发生上皮细胞-间质转化(EMT)的重要标志[8]，本研究结果进一步证实TROP2及其下游基因的表达与肿瘤的发生相关。免疫组织化学法均提示食管癌组织存在TROP2蛋白高表达。此外，食管癌患者TROP2蛋白表达与患者肿瘤分化程度、浸润深度、病理分期、淋巴结转移相关。多因素Logistic回归分析提示,肿瘤浸润深度、病理分期与TROP2蛋白表达相关，提示TROP2蛋白可能参与食管癌的发生及发展过程。既往关于TROP2在食管癌组织的表达相关研究较少，周永清等[9]以胃癌组织作为研究材料，证实胃癌组织中TROP2 蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及病理分期相关；国外一项研究也证实，TROP2 蛋白在肺腺癌组织中存在高表达(67%)[10]。本研究在前人研究结果基础上,进一步证实TROP2蛋白参与食管癌的发生及发展。目前TROP2蛋白影响恶性肿瘤生物学行为的相关机制尚未明确，研究认为可能与TROP2 蛋白参与EMT 相关蛋白调节相关。EMT是上皮细胞在病理条件下向间质细胞转化的现象，这一过程可伴细胞去极性、细胞形态改变、上皮细胞分子标记减少、基质金属蛋白酶相关成员活性增加等[11-12]。杨勇等[13]开展的一项细胞学研究证实，抑制食管癌TROP2基因表达可降低肿瘤细胞增殖、侵袭的能力，其机制与下调基质金属蛋白酶-2、磷脂酰肌醇-3激酶相关。

本研究分析了TROP2蛋白与食管癌患者预后的关系，结果显示，TROP2蛋白阳性表达患者生存率明显低于阴性表达患者，这一结果与既往其他恶性肿瘤的相关报道一致[14-15]。如前文研究所示，TROP2蛋白表达量与肿瘤侵袭性呈一定程度相关，TROP2蛋白表达阳性患者可能病情进展更为迅速，局部复发风险更高，因此预后相对较差。目前多数研究认为食管癌患者的预后受到肿瘤浸润深度、淋巴结转移及病理分期等诸多因素的影响[16-17]，本研究COX多因素分析提示，在校正其他因素后，TROP2蛋白高表达的患者预后不良的风险为低表达患者的1.454倍，提示TROP2蛋白的表达情况与食管癌患者预后相关，可作为早期预后评价的参考指标。但本研究存在一定局限，因样本量有限，在预后评估方面对术后治疗方案未进行分析，可能使结果存在一定误差，下一步工作仍将扩大样本量，并将治疗相关因素纳入研究。

4 结 论

综上所述，食管癌组织存在TROP2蛋白表达明显升高，其表达情况与患者肿瘤侵袭性及预后均有一定关系。