不同病理类型食管癌GRP78、GRP94表达及与预后的关系分析

彭 蓉，娜吧错，益西卓呷，吕婷婷

食管癌为消化系统常见恶性肿瘤，好发于食管黏膜上皮及腺体，全球每年约有30万人死于食管癌，我国为食管癌高发地区之一，90%以上为鳞状细胞癌，以进行性吞咽困难、胸骨后疼痛等为主要症状，病因多与人群分布、饮食习惯及遗传易感性等紧密相关[1]。因早期食管癌患者缺乏典型临床症状，大多数确诊时已处于中晚期，此时食管癌患者临床治疗效果差且生存率低，研究指出单纯参照食管癌患者TNM分期并不能准确地判断预后，而尽早准确判断食管癌预后对降低其病死率有一定积极作用[2]。随着分子生物学快速发展，越来越多研究证实肿瘤标志物与肿瘤发生、进展、预后有关[3-4]。葡萄糖调节蛋白(glucose regulatory protein， GRPs)为一种应激蛋白，在低糖及缺氧情况下其合成量明显升高，可协助蛋白质折叠、运输以及装配，有学者研究证实GRP78、GRP94与人类肿瘤有关[5]；国内对不同病理类型食管癌GRP78表达及其与预后关系尚未完全明确，本研究采用免疫组化法检测GRP78、GRP94在不同病理类型食管癌中的表达情况，通过分析GRP78、GRP94与食管癌患者病理参数及其预后的关系，以期为食管癌患者的早期诊治提供有用参考信息。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2010年1月—2014年1月在我院外科手术治疗的78例食管癌石蜡包埋癌组织和30例癌旁石蜡包埋组织(癌旁组织距癌组织5 cm以上)。标本来源病例的一般资料：男42例，女36例，年龄21～68(45.12±3.16)岁；临床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例；病理类型：腺癌22例，鳞癌56例；分化程度：低分化34例，中分化24例，高分化20例。所有标本均经本院病理科进一步检验，本研究征得本院医学伦理委员会批准同意，获得患者知情同意，且均获得有效随访。

1.2方法

1.2.1免疫组化法染色：组织切片脱蜡水化-消除内源性过氧化物酶活性-抗原修复-滴加一抗-滴加二抗-DAB显色-染色-脱水、透明-封片；GRP78、GRP94阳性结果判定：细胞着色于细胞浆，呈棕黄色[6]，采用半定量积分法判定染色强度，每例随机观察5个高倍视野，取其平均值，阳性细胞所占比例≤5%记为0分，6%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分；阳性细胞表达着色深度：不着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色各记为0、1、2、3分，两项积分相乘所得分0～2分记为阴性，3～4分记为弱阳性，5～8分记为中阳性，9～12分记为强阳性，本研究中将≥3分记为GRP78或GRP94高表达，<3分记为GRP78或GRP94低表达。

1.2.2GRP78、GRP94 mRNA检测：以管家基因β-actin为内参基因，应用Trizol试剂提取组织总RNA，逆转录试剂合成第一条DNA链，随后进行PCR扩增，扩增条件：5℃，10 min；(95℃，15 s；60℃，45 s)×40；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；60℃，15 s。扩增完毕后进行葡聚糖凝胶电泳，采用系统自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析GRP78、GRP94的mRNA表达量，每个样本重复3次取平均Ct值(若相差0.5个Ct值舍弃)，相对定量采用2-ΔΔCt法检测癌组织及癌旁组织中GRP78 mRNA表达情况，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.2.3GRP78、GRP94蛋白相对表达量检测：采用Western blotting检测2组组织中GRP78、GRP94蛋白表达情况，收集GRP78、GRP94蛋白样品，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品的蛋白浓度，随后应用SDS-PAGE凝胶试剂盒(p0012A)配制SDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品中加适量SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃热水中加热，蛋白充分变性后待其冷却，在室温中将蛋白样品直接上样至SDS-PAGE凝胶加样孔中即可，SDS-PAGE电泳液进行电泳，待电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行转膜操作(电流为300～400 mA，转膜时间为30～60 min)，转膜时可使用多功能电泳仪，采用快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，随后将蛋白膜放置在预先准备好的洗涤液中漂洗，经过一抗孵育-二抗孵育后，回收二抗，加洗涤液，共洗涤3次，采用BeyoECL pLUS试剂检测蛋白。

1.2.4随访：生存时间以患者手术当日为起点，随访截止日期(末次随访时间为术后3年)或患者死亡时间为终点。

2 结果

2.1GRP78、GRP94在不同食管组织中表达情况 食管癌腺癌组织GRP78和GRP94高表达率均高于食管鳞癌组织和癌旁组织，且鳞癌组织高于癌旁组织(P<0.05)。见表1。不同食管组织中GRP78免疫组化染色情况见图1、2。

图1 GRP78在不同食管癌组织及癌旁组织中的免疫组化染色情况(DAB×400)

图2 GRP94在不同食管癌组织及癌旁组织中的免疫组化染色情况(DAB×400)

表1 GRP78、GRP94在不同食管组织中表达情况[例(%)]

2.2不同病理类型食管癌组织中GRP78、GRP94 mRNA、蛋白表达情况 食管癌腺癌组织GRP78 mRNA、GRP78蛋白相对表达量明显高于食管癌鳞癌组织，差异有统计学意义(P<0.01)。食管癌腺癌组织GRP94 mRNA、GRP94蛋白相对表达量与食管癌鳞癌组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

表2 不同病理类型食管癌组织中GRP78、GRP94 mRNA、蛋白表达情况

图3 食管癌组织中GRP78、GRP94蛋白表达情况

2.3GRP78、GRP94表达水平与食管癌临床病理参数的关系分析 GRP78高表达率与临床分期、分化程度、病理类型有关，而GRP94高表达率与临床分期、分化程度有关(P<0.05)。见表3。

表3 GRP78、GRP94与食管癌临床病理参数的关系分析[例(%)]

2.4食管癌组织中GRP78、GRP94表达与预后关系的分析 依据食管癌组织GRP78、GRP94表达水平高低分为GRP78低表达组、GRP94低表达组、GRP78高表达组、GRP94高表达组，78例食管癌患者均随访至术后3年，失访率为0，随访结果发现GRP78低表达组术后3年生存率76.47%(13/17)明显高于GRP78高表达组40.98%(25/61)，GRP94低表达组术后3年生存率82.61%(19/23)明显高于GRP94高表达组36.36%(20/55)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、5。

图4 GRP78高表达与低表达组食管癌患者的生存曲线GRP78为葡萄糖调节蛋白78

图5 GRP94高表达与低表达食管癌患者的生存曲线GRP94为葡萄糖调节蛋白94

3 讨论

食管癌发生发展与多种环境因素以及人类基因组相互作用有关[7]，现代医学研究表明，食管癌演变过程为正常黏膜、基底细胞过度增生、不典型增生、原位癌、浸润癌，随着现代医学水平不断提高,食管癌手术切除率显著升高，手术死亡率有所降低，但目前为止食管癌术后生存率仍不乐观，主要是因为食管癌缺乏早期典型症状，临床确诊时多已失去最佳手术治疗时机，因此食管癌早期诊断对改善患者预后尤为重要[8-9]。随着分子生物学研究不断深入，国内外学者发现不少与食管癌发生发展密切相关的分子生物学指标，近期有研究指出GRP78与肿瘤发生发展、耐药、复发转移等有关[10]，如卵巢癌、神经细胞母细胞瘤、胃癌、肺癌等肿瘤中均可检测到GRP78表达，GRP78也被称为免疫球蛋白重链结合蛋白，其作为一个重要内质网分子伴侣常定位于真核生物细胞内质网膜上，有多种功能，如参与蛋白质折叠及转运、维持内环境稳定等生理过程[11-12]，相关研究证实GRP78可在一定程度上降低细胞对杀伤性T细胞的敏感度，阻碍细胞凋亡，而肿瘤细胞同样存在GRP78的保护作用，GRP78同样可降低细胞毒性T细胞对肿瘤细胞杀伤力，促进肿瘤细胞增殖以及耐药性产生[13-14]。食管癌作为全球范围内危害人类生命安全的常见恶性肿瘤，早期准确诊断其病理类型及预后对降低患者病死率有重要临床意义。

GRP78、GRP94是糖调节蛋白家族中被研究最多的蛋白，主要在内质网中稳定表达，在基础表达水平上发挥重要的生理作用，董孝成等[15]对不同组织学类型食管癌GRP78表达及其临床病理特征的相关性进行了探究，结果发现食管癌腺癌组织GRP78阳性率明显高于食管癌鳞癌组织及正常食管组织，同时证实了GRP78可能参与了食管癌变发生过程；而胡永伟等[16]文献报道则表明GRP78阳性患者的中位生存期为49.78个月(95%CI:44.09,55.46个月)短于阴性患者的62.21个月(95%CI:53.29,71.14个月)；Hsu等[17]研究也证实GRP78在肿瘤组织中呈高表达；关心等[18]研究则证实结直肠癌组织中GRP78、GRP94高表达可能与结直肠癌发生、生长、侵袭、转移及预后有关，或可作为肿瘤进展和预后的客观指标。本研究发现，食管癌鳞癌组织GRP78、GRP94高表达率较食管癌癌旁组织明显高，证实了GRP78、GRP94可能参与了食管癌疾病发生、发展病理过程中，与李洪标等[19]研究的观点大体相符；本研究结果还显示，食管癌腺癌组织GRP78 mRNA和蛋白相对表达量明显高于食管癌鳞癌组织，提示术前监测食管癌患者GRP78表达水平或有利于临床医师为食管癌患者制定合理治疗方案[20]。此外，本研究随访结果发现，GRP78、GRP94低表达组术后3年生存率高于GRP78、GRP94高表达组，提示GRP78、GRP94水平高低可较好预测食管癌患者预后状况，未来GRP78、GRP94有望成为判断食管癌预后的有效指标。

综上所述，本研究的创新之处是，初步证实了GRP78、GRP94与食管癌病理特征及其预后的关系，为食管癌患者的早期诊断、预后评估等方面提供了理论依据，临床中或可通过严密监测食管癌组织中GRP78表达情况，以预测肿瘤的恶性程度和预后状况。