低温胁迫下不同玉米自交系对外源甜菜碱的生理响应

赵小强,方 鹏,彭云玲,张金文

(甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070)

低温冷害是导致我国粮食产量波动的重要限制因素之一，其具有大尺度性、综合性及地理区域差异性。玉米(ZeamaysL.)是集粮食、饲料、工业用途为一体的多功能作物，在保障国计民生中发挥着重要作用。由于玉米起源于热带、亚热带，是一种喜温、短日照C4作物，生育期内对温度要求较高，遇低温冷害时易受到伤害[1-2]。萌发期遇到10℃以下低温时，玉米种子的发芽势、发芽率、种子活力明显降低；5℃以下低温时玉米种子不能发芽，且易感染病害而引发烂种[3-5]。苗期遇到10℃以下低温时玉米幼苗生长明显受到抑制，生理代谢紊乱；6～8℃低温时幼苗停止生长；更低温度时玉米幼苗细胞和组织产生不可逆的伤害，幼苗死亡[6-7]。花期遇到18℃以下低温时抑制玉米开花[8]。灌浆期遇到20℃以下低温时灌浆速度明显减缓；16℃以下低温时则明显影响玉米淀粉酶活性而抑制碳水化合物的运输与累积，进而导致减产[9]；收获到脱粒前玉米种子含水量一般高于30%，这时极易发生0℃以下低温致使种子活力丧失[5]。其中萌发期和苗期玉米对低温冷害最为敏感，因而，深入研究低温冷害对玉米萌发及幼苗的伤害机理，探索玉米耐寒性响应机制，筛选、鉴定、创制耐寒种质资源及寻找提高玉米耐寒性的有效方法一直是学者关注的热点。

马彦华等[3]在2℃低温培养6 d后用存活率鉴定了36份玉米自交系的耐寒性强弱，筛选出7份强耐寒性自交系，并发现来自俄罗斯的自交系芽苗期耐寒性显著强于其他地区的材料。彭云玲等[10]在6、10、15℃和25℃培养下用发芽率、胚芽长、胚根长、根数等综合评价了44份玉米自交系的耐寒性强弱，并筛选出3份强耐寒性自交系，为今后玉米耐寒种质筛选、鉴定与利用提供了可靠的技术支撑和材料。另外，学者一直在寻求增强植物耐寒性的简单、高效方法，而外源调节物质符合这一要求，主要包括渗透调节物质[11-12]、植物生长调节剂[6,13]、信号分子[6,14-15]、营养元素[16]等，因其具有抗逆性广、用量小、见效快、效益高等特点，同时又能促进植物的生长发育，是发展可持续农业的一项重要技术，因此该技术已被广泛应用到逆境胁迫下多种植物的安全生产实践中。

甜菜碱(GB)是一类重要的渗透调节物质，广泛存在于动物、植物及微生物体内。研究表明当植物受到逆境(低温、高温、干旱、盐渍、重金属离子、水涝等)胁迫时，外源GB可参与植物细胞的渗透调节、稳定膜和蛋白等亚细胞结构及清除活性氧、进而能够有效地保护细胞抵御逆境胁迫造成的伤害[17-21]。然而目前外源GB对玉米低温冷害的缓解效果及其在提高玉米耐寒性的响应机理等方面的研究罕见报道，为此，本研究以课题组前期筛选、鉴定的3份寒敏感和3份耐寒性玉米自交系为试材，在10℃低温胁迫下于萌发期和苗期添加外源GB后，研究其对低温胁迫下不同基因型自交系种子萌发和幼苗的影响，揭示玉米耐寒性响应机理，并综合评价外源GB对不同基因型自交系的调节效果，以期为外源GB在改善低温逆境下玉米生长发育及生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验于2016年3—10月在甘肃农业大学进行。供试材料为本课题组在2014—2015年间筛选、鉴定的3份寒敏感玉米自交系H105W、K22、B68和3份耐寒性自交系ND246、Va35-2、Va102[10]。

1.2 试验方法

1.2.1 种子预处理 选择饱满、均匀一致的玉米种子，先用0.5%的NaClO消毒10 min后用双蒸水冲洗3次，且用灭菌滤纸吸干附着水，再分别以5种不同相应浓度的GB溶液及双蒸水常温25℃浸种24 h，以备试验所需。5种GB溶液浓度分别为：T1(10 μmol·L-1)，T2(20 μmol·L-1)，T3(30 μmol·L-1)，T4(40 μmol·L-1)，T5(50 μmol·L-1)。

1.2.2 低温萌发试验 将T1～T5溶液浸种后的3份寒敏感自交系种子各30粒，分别置于消毒发芽盒中，双层灭菌滤纸作发芽床，并加入相应浓度的GB溶液，将其置于气候培养箱中于(10±1)℃和(25±1)℃先后暗培养各7 d，以双蒸水浸种并用其培养的种子作为对照处理，其中(25±1)℃气候培养箱中暗培养14 d的种子作为正向对照CK(+)，(10±1)℃和(25±1)℃气候培养箱中先后暗培养各7 d的种子作为负向对照CK(-)，各处理3次重复。气候培养箱相对湿度60%～80%，培养期间每2 d补一次对应浓度溶液各15 mL，待种子暗培养第10 d时统计发芽势，第14 d统计发芽率，并测量其他萌发性状。参照赵小强等[12]方法，于萌发期筛选出外源GB的最佳低温缓解浓度。再按上述方法分别在CK(+)、CK(-)及最佳低温缓解浓度外源GB处理下培养6份自交系并测定各萌发性状。

1.2.3 幼苗生长试验 先将灭菌蛭石与双蒸水按5 g∶1 mL比例均匀混合，再将T1～T5溶液及双蒸水浸种后的3份寒敏感自交系种子各30粒，分别播于装有灭菌蛭石的营养钵中。将其置于昼/夜温度为(25±1)℃/(20±1)℃气候培养箱中培养，待双蒸水浸种的种子长至三叶一心时，用双蒸水快速洗掉幼苗根部蛭石，并用滤纸吸干附着水，再将幼苗分别置于300 mL相应浓度的GB溶液中，并置于昼/夜温度为(10±1)℃/(6±1)℃气候培养箱中继续培养7 d作为试验处理。以双蒸水浸种并用其培养的幼苗作为对照处理，其中以昼/夜温度为(25±1)℃/(20±1)℃气候培养箱中继续培养7 d的幼苗作为正向对照CK(+)，昼/夜温度为(10±1)℃/(6±1)℃气候培养箱中继续培养7 d的幼苗作为负向对照CK(-)。幼苗培养期间每天光照12 h，光照强度600 μmol·s-1·m-2，相对湿度60%～80%。3次重复，每一处理下测定幼苗第3片叶的各生理性状。参照赵小强等[12]方法，苗期筛选出外源GB的最佳低温缓解浓度，再按上述方法分别在CK(+)、CK(-)及最佳低温缓解浓度外源GB处理下培养6份自交系并测定幼苗叶片各生理性状。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 玉米生长与生理性状测定 玉米发芽势及发芽率按以下公式计算：

发芽势[22]=10 d内正常发芽种子总数/供试种子总数×100%

(1)

发芽率[22]=14 d内正常发芽种子总数/供试种子总数×100%

(2)

各处理取长势一致的种子10粒，测定胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重；苗期各处理取长势一致的幼苗3株，测定第3片叶的相对电导率(RC)[12]、丙二醛(MDA)含量[12]、脯氨酸(Pro)含量[21]、可溶性糖(SS)含量[22]、超氧化物歧化酶(SOD)活性[21-22]、过氧化物酶(POD)活性[21-22]、过氧化氢酶(CAT)活性[21-22]。

1.3.2 单个性状的外源调节物质低温缓解指数 借鉴赵小强等[12]方法计算各性状的外源GB低温缓解指数(ease index，EI)为：

(3)

(4)

式中，EIiTn为第i个性状第Tn种浓度下的外源调节物质低温缓解指数；XTn为第Tn种浓度下相应性状测定值；XCK(+)为CK(+)处理下的测定值；XCK(-)为CK(-)处理下的测定值。若测定性状与耐寒性正相关，则用(3)式，反之用(4)式。EI为正值表示相应浓度的外源GB对低温胁迫起正向缓解作用，负值表示相应浓度外源GB对低温胁迫起负向缓解作用。

1.3.3 外源调节物质低温缓解能力综合评价 以各测定性状的EI作为低温缓解评价指标，采用隶属函数法综合评价外源GB的低温缓解效果[12]为：

(5)

(6)

式中，UiTn为第i个性状第Tn种浓度下的外源GB低温缓解隶属值，EIimax为第i个性状第n种浓度下的最大EI，EIimin为第i个性状第n种浓度下的最小EI。若EI与外源GB的缓解效果正相关，则用(5)式，反之用(6)式，累加各隶属值并求均值，均值越大，外源GB的低温缓解效果越好。

1.4 数据统计分析

试验数据均采用Microsoft Excel 2016进行处理和绘图，采用IBM SPSS 19.0进行Duncan多重比较方差分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下外源GB的最佳低温缓解浓度筛选

以3份寒敏感自交系为试材，萌发期和苗期分别测定各处理下的6个萌发性状及7个幼苗生理性状，然后计算出各性状的EI并将其作为外源GB低温缓解综合评价指标，再采用隶属函数法综合评价不同外源GB的低温缓解效果。由表1可知，萌发期和苗期低温胁迫下，随外源GB浓度的增大其低温缓解效果呈先增后减的趋势，其中萌发期外源GB的最佳低温缓解浓度为T2(20 μmol·L-1)，苗期外源GB的最佳低温缓解浓度为T1(10 μmol·L-1)。

表1 低温胁迫下外源GB的低温缓解效果综合评价

2.2 外源GB处理下玉米自交系萌发和幼苗生理相关性状的差异分析

表2和表3可知，在CK(+)、CK(-)及最佳低温缓解浓度外源GB处理下培养了3份寒敏感自交系和3份耐寒性自交系，萌发及幼苗相关性状方差分析显示，6个萌发性状和7个幼苗生理性状在自交系间、在外源GB浓度间、在其互作间差异均显著(P<0.01)；且低温胁迫下外源GB浓度对这13个性状的影响最大，自交系对这13个性状的影响次之，其互作间对这13个性状的影响最小，且F值依次减小。说明萌发期和苗期低温胁迫下，不同玉米基因型间、外源GB浓度间及其互作间均能显著影响玉米种子萌发和幼苗生理特性，但外源GB对玉米种子萌发和幼苗生理特性的影响远远大于自交系本身及其互作间的影响，因此，较耐寒性玉米而言，生产实践中施加外源GB能更有效地改善低温胁迫对玉米种子的萌发和幼苗的生理伤害。

表3 外源GB处理下玉米自交系幼苗性状的方差分析(F值)

表2 外源GB处理下玉米自交系种子萌发性状的方差分析(F值)

2.3 外源GB处理对玉米自交系种子萌发相关性状的影响

不同基因型自交系种子萌发对低温胁迫的敏感程度不同(P<0.05)。CK(-)处理下，6份自交系的6个萌发性状都显著降低，但与耐寒性自交系相比，寒敏感自交系6个萌发性状的变化更加明显(图1)，说明低温胁迫能显著抑制玉米种子萌发，但低温胁迫对耐寒性玉米种子萌发的抑制效应显著低于寒敏感玉米。低温胁迫下添加最佳浓度T2(20 μmol·L-1)外源GB将有效地促进玉米种子萌发(P<0.05)。且3份寒敏感自交系的6个萌发性状分别是CK(-)处理的6.3、1.9、2.7、1.3、1.1和2.8倍，而3份耐寒性自交系的6个萌发性状分别是CK(-)处理的1.1、1.4、2.4、1.3、2.0和2.2倍(图1)。说明低温胁迫下，添加最佳浓度外源GB后玉米6个萌发特性的改善效果不同，整体而言，寒敏感玉米的6个萌发性状比耐寒性玉米的改善效果更强。

注：不同大写字母表示同一自交系不同处理下P<0.01水平差异显著。下同。Note: Different capital letters in the same inbred line indicated significant difference at P<0.01 level. The same below.图1 低温胁迫下添加最佳浓度外源GB后对玉米自交系种子萌发的影响Fig.1 Effects of the optimal exogenous GB on maize seed germination for inbred lines under low temperature stress

2.4 不同处理对玉米自交系幼苗生理相关性状的影响

不同基因型自交系幼苗遭受低温伤害时，其体内一系列生理代谢发生紊乱，幼苗明显受到伤害(P<0.05)。CK(-)处理下6份自交系的7个幼苗生理性状都显著升高，但与耐寒性自交系相比，寒敏感自交系7个幼苗生理性状的变化更加明显(图2)。说明低温胁迫时玉米幼苗明显受到伤害，但耐寒性玉米幼苗受伤害程度明显小于寒敏感玉米。低温胁迫下添加最佳浓度T1(10 μmol·L-1)外源GB将有效地改善玉米幼苗受到的生理伤害，但不同自交系间差异显著(P<0.05)。且3份寒敏感自交系的7个生理性状分别是CK(-)处理的0.4、0.6、1.2、1.3、1.0、1.3和1.5倍，而3份耐寒性自交系的7个生理性状分别是CK(-)处理的0.8、0.8、1.2、1.2、1.2、1.3和1.6倍(图2)。说明低温胁迫下，添加最佳浓度外源GB后玉米7个幼苗生理特性的改善效果不同，整体而言，寒敏感玉米的7个生理性状比耐寒性玉米的改善效果更强。

图2 低温胁迫下添加最佳浓度外源GB后对玉米自交系幼苗生理性状的影响Fig.2 Effects of the optimal exogenous GB on maize seedling physiological traits for inbred lines under low temperature stress

2.5 低温胁迫下添加最佳浓度外源GB后玉米自交系相关性状的低温缓解指数分析

由表4可知，萌发期低温胁迫下，添加最佳浓度T2(20 μmol·L-1)外源GB对不同自交系6个萌发性状的缓解方向和大小存在差异，其EI不尽相同(P<0.05)。且低温胁迫下，添加T2外源GB后6份自交系各萌发性状EI的变异系数介于15.75%～132.25%之间。

表4 低温胁迫下添加最佳外源GB后不同玉米自交系种子萌发性状的低温缓解指数(EI)

由表5可知，苗期低温胁迫处理下，添加最佳浓度T1(10 μmol·L-1)外源GB对不同自交系7个幼苗生理性状的缓解方向和大小存在差异，其EI不尽相同(P<0.05)。且低温胁迫下，添加T1外源GB后6份自交系各幼苗生理性状EI的变异系数介于14.51%～95.40%之间。

表5 低温胁迫下添加最佳外源GB后不同玉米自交系幼苗性状的低温缓解指数(EI)

2.6 低温胁迫下添加最佳浓度外源GB后玉米自交系低温缓解效果综合评价

低温胁迫下，以萌发、幼苗相关性状EI作为外源GB低温缓解评价指标，采用隶属函数法综合评价6份自交系的外源GB低温缓解效果。由表6可知，低温胁迫下，萌发期T2(20 μmol·L-1)浓度外源GB的平均低温综合缓解隶属值为0.585，变异系数为44.22%，其在自交系间差异显著(P<0.05)，且耐寒性自交系ND246的外源GB低温缓解效果最佳，其隶属值为0.866；寒敏感自交系K22的外源GB低温缓解效果最小，其隶属值为0.175。苗期低温胁迫下，T1(10 μmol·L-1)浓度外源GB的平均低温综合缓解效果其隶属值为0.454，变异系数为14.71%，其在自交系间差异显著(P<0.05)，且耐寒性自交系Va35-2的外源GB低温缓解效果最佳，其隶属值为0.523，耐寒性自交系ND246的外源GB低温缓解效果最小，其隶属值为0.383。

表6 低温胁迫下添加最佳外源GB后不同自交系的低温缓解效果综合评价

3 讨论与结论

从播种到幼苗形态建成是玉米最容易遭受低温冷害的关键时期，萌发期遭受低温冷害时玉米种子活力下降，发芽势、发芽率降低，导致出苗差甚至引起烂种等现象，而苗期遭受低温冷害时，玉米幼苗生理代谢紊乱，长势变弱甚至出现死苗现象[3-7]。本试验研究表明，萌发期遭受10℃低温冷害时明显抑制玉米种子萌发，因而其发芽势、发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重、胚根鲜重均显著降低，而苗期遭受10℃低温冷害时玉米幼苗受到一定伤害，导致叶片的膜脂过氧化程度、细胞渗透调节能力及活性氧清除能力均显著增强，因而其相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD、POD、CAT活性均显著升高，且与3份寒敏感自交系相比，低温胁迫下3份耐寒性自交系萌发较好，幼苗伤害较轻，抗寒性较强。因此，倒春寒和寒潮易发生的玉米种植区应积极推广耐寒性较强的玉米品种。

植物遭受逆境胁迫时，外源GB可作为渗透调节物质参与植物细胞的渗透调节，亦可作为渗透保护物质进而提高植物的抗逆性[17-22]。基于上述考虑，本试验在10℃低温胁迫下，利用3份寒敏感自交系玉米种子在萌发期和苗期分别筛选出最佳外源GB低温缓解浓度为20 μmol·L-1和10 μmol·L-1，并在萌发期和苗期分别探索了最佳浓度外源GB对不同基因型玉米种子萌发及幼苗生理伤害的缓解机理与效果。结果表明，低温胁迫下添加最佳浓度外源GB后会显著增强玉米种子活力，其发芽势、发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重和胚根鲜重显著升高，而其在不同自交系间的升高程度不同。整体而言，添加最佳浓度外源GB后对寒敏感自交系6个萌发性状的缓解效果明显大于耐寒性自交系。低温胁迫下添加最佳浓度外源GB后对玉米幼苗的伤害具有显著的缓解效果，其相对电导率和丙二醛含量显著降低，而脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性和CAT活性显著升高，而其在不同自交系间的缓解能力不同。整体而言，添加最佳浓度外源GB后对寒敏感自交系7个幼苗生理性状的缓解效果明显大于耐寒性自交系。另外，本试验还表明，低温胁迫下玉米的6个萌发性状及幼苗7个生理性状在自交系间、在外源GB浓度间、在其互作间差异均显著，且6个萌发性状和7个幼苗生理性状在外源GB浓度间的差异(F值)远远大于自交系间及其互作间的差异。说明生产实践中，较选育及推广耐寒性玉米品种相比，通过施加相应浓度的外源GB能更有效地改善低温胁迫下玉米种子萌发及幼苗生理代谢，进而提高玉米的耐低温能力。

为了比较低温胁迫下最佳浓度外源GB对玉米种子萌发和幼苗的低温缓解效果，以6个萌发性状和7个幼苗生理性状的外源GB低温缓解指数EI为低温缓解评价指标[12]，采用隶属函数法综合评价了最佳浓度外源GB对不同玉米的低温缓解效果。结果表明，低温胁迫下萌发期最佳浓度外源GB对玉米的低温缓解效果(0.585)优于苗期(0.454)，这可能与玉米种子在吸胀萌发时对受损伤的细胞膜结构进行修复，对种子形成及萌发过程中产生的活性氧等各种有害物质的清除、生长活性物质的分解及玉米幼苗本身的逆境抵抗能力有关。Hoque等[18，23]研究也表明，盐胁迫下添加外源GB后烟草主要通过提高SOD、CAT等活性进而减轻盐胁迫对烟草的不利影响。因此，当玉米萌发期和苗期遭遇低温冷害时，可选择相应浓度的外源GB来提高玉米的耐寒性，进而减轻低温冷害对玉米造成的损害。